一種用于檢測基因變異的PCR引物設計方法及試劑盒技術

本發明專利技術涉及一種用于檢測基因變異的PCR引物設計方法及試劑盒，該引物設計方法包括：在基因同源和保守的區域設計正向PCR通用引物，所述正向PCR通用引物的5’端附加一段與基因變異區域野生型完全互補6~20個堿基的寡核苷酸；在變異基因的位置設計與變異基因完全互補的反向引物；所述的試劑盒，包括：dNTPs、Mg2+、Taq?DNA聚合酶、Tris-KCl體系、引物和探針。本發明專利技術的引物設計方法易于設計、可控且擴增靈敏度高；本發明專利技術的試劑盒靈敏度高、特異性強、時間短、使用操作步驟少。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因變異的檢測方法及試劑盒領域，特別涉及一種用于檢測基因變異的PCR引物設計方法及試劑盒。
技術介紹
基因變異在生物體中時刻發生，有的變異是無意的，它不影響生物體正常生長，但是，總有一些變異后果非常嚴重，給人類的生存帶來挑戰?？茖W工作者專利技術了許多檢測基因變異的方法，具體包括PCR-限制性酶切分析、PCR-SSCP分析、PCR-測序分析、PCR-基因芯片分析、PCR-LDR、連接酶反應LDR、PCR-HRM分析、ARMS-PCR等。其中最為常用方法為PCR-限制性酶切分析、PCR-測序分析、PCR-基因芯片分析、PCR-HRM分析、ARMS-PCR。PCR-限制性酶切分析是針對位點明確、且突變型與野生型在序列上至少存在一種酶切位點差異。PCR完成后，用該酶進行酶切后，測序鑒定。耗時、·繁瑣，但靈敏度高。對于有些樣品由于野生型和突變型之間無差異酶切位點，導致該方法不可用。PCR-測序分析是突變檢測的金標準方法，可發現未知變異位點。實驗周期久、靈敏度低(10%左右)。PCR-基因芯片分析是針對大量已知突變位點的有效方法，但是其靈敏度僅能做到59TlO%，且成本較高。PCR-HRM分析成本低、通量大，由于不能自動化分析結果，需實驗人員判讀，僅在科研中有所應用。ARMS-PCR是目前開發基因變異最為常用技術，系統中包含通用引物和變異區域特異引物(以后簡稱“變異引物”)。通用引物可與野生型和突變型同時結合、變異引物與基因變異區域完全互補，與野生型僅在3端有I飛個堿基的差異，因此基因變異的檢測完全依賴于變異引物的設計好壞決定試劑盒的靈敏度和特異性(見圖I)。由于變異引物與野生型模板僅有廣3個堿基不互補，也存在一定幾率結合而發生錯誤弓I導的PCR合成，這種結合的概率很高，約為O. 19Tl%。一旦發生此類反應，則結果和試劑盒的可靠性大大下降。影響此類反應的因素主要是核酸提取殘留鹽離子、模板濃度過高兩個，這兩個因素在實際應用中不是可控因素，因此無法在研究測試初期通過優化反應條件來降低。歐洲DxS基于ARMS-PCR/Scorpion系統開發的K_ras試劑已獲得CE認證，并在SFDA提出注冊申請。因此基于ARMS-PCR開發新的分子診斷試劑盒是一個較為可靠的方法。由于基因變異，面對復雜的基因變異，傳統的分子診斷方法顯得很無力，這是因為在此類基因變異樣品中，含有大量的野生型背景，從而為鑒別這些重要基因是否發生后果嚴重的變異帶來巨大麻煩。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種用于檢測基因變異的PCR引物設計方法及試劑盒，該方法易于設計、可控，該試劑盒靈敏度高、重復性好，穩定可靠。本專利技術的一種用于檢測基因變異的PCR引物設計方法，包括在基因高度(基因序列相似性大于80%)同源和保守的區域設計正向PCR通用引物，所述正向PCR通用引物的5’端附加一段與基因變異區域野生型完全互補6 20個堿基的寡核苷酸；在變異基因的位置設計與變異基因完全互補的反向引物。所述的寡核苷酸與基因變異區域野生型完全互補的堿基數為8 15個。所述的寡核苷酸的退火溫度在37飛5°C之間。將所述的PCR引物設計方法與實時熒光PCR、PCR-ELISA, PCR-反向分子雜交或PCR-基因芯片技術聯合使用。一種用于檢測基因變異的試劑盒，包括dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl體系、引物和探針；所述的引物包括正向引物和反向引物；所述的正向引物包括正向PCR通用 引物和附加于通用引物的5’端的一段與基因變異區域野生型完全互補6 20個堿基的寡核苷酸；所述的反向引物設計在變異基因的位置，且與變異基因完全互補。所述的Taq DNA聚合酶的用量為O. 5 IU/測試；Mg2+的濃度為O. 5 I. 5mM ;所述的Tris-KCl體系中KCl濃度為3(T50mM，甘油的質量濃度為10% ;引物和探針的用量為各IOP/測試。對于野生型的擴增，本專利技術中所述正向通用引物附加寡核苷酸優于反向引物與野生型模板結合而阻止野生型擴增；對于突變型的擴增，由于所述正向通用引物附加寡核苷酸與之不完全配對，因此反向引物可以結合到突變基因模板上進行擴增。根據本專利技術的基因變異檢測PCR引物設計方法，通用引物可以引導一個DNA鏈合成，當此次合成DNA鏈時野生型時，“變性一退火”后，可發生自身引導合成的DNA鏈內折疊，阻礙變異引物與野生型模板結合，稱之為阻遏ARMS-PCR系統。在此阻遏ARMS-PCR系統中，通用引物的5端附加一段與變異引物高度同源、但與變異基因的野生型完全互補的寡核苷酸序列(見圖2)，該序列在分子內優先與變異基因的野生型結合，從而抑制或阻礙了變異引物與野生型結合的幾率(見圖3)，解決了變異引物特異性問題，從而極大的提高了變異引物的靈敏度。具體而言,如圖2所不,本專利技術的通用引物分為A、B兩部分，B部分為正常的PCR引物，A部分為與變異引物C相互競爭結合位點的寡核苷酸序列。通用引物B段與野生型模板D段和突變型模板F段完全互補，是PCR合成的一個引導鏈；變異引物C與突變型模板G’完全互補，是PCR合成的另一個引導鏈。H與H’區是設計熒光探針和雜交探針的位置；E和E’是野生型發生基因變異的位置。G和G’是E和E’發生基因變異的新序列。在適當的條件下，A部分與野生型E’結合效率高于變異引物C ;變異引物C更易于G’結合。特別是，反應完成第I個循環后(如圖3所示)，通用引物合成的野生型DNA鏈在“變性一退火”過程中，會自動形成發卡結構，從而屏蔽掉變異引物的結合位點。此類分子內折疊的效率通常比分子間結合效率高10倍以上，因此能取得較好的屏蔽效果。本專利技術公開的引物設計方法中引物設計參照通用的引物設計原則不允許引物間或/和引物內3’端出現5個以上堿基互補；變異引物的長度在15bp 25bp之間，退火溫度(用軟件Primer Express 3· O計算)在42 60°C之間；優選變異引物的長度在16bp 22bp之間，退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計算)在48、2°C之間；通用引物B區的長度在15bp 25bp之間，退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計算)在42 60°C之間；優選通用引物B區的長度在16bp 20bp之間,退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計算)在48 52°C之間；通用引物A區的長度在6 20bp之間,退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計算)在37 55°C之間；可能發生變異的區域設計在通用引物A區的較中間的位置。本專利技術的基因變異的PCR弓丨物設計方法，其特點是在ARMS-PCR弓丨物設計中，在通用引物中附加一段與基因變異區域的野生型完全互補序列，該序列在PCR退火時，會優于針對變異基因設計的變異基因檢測引物退火到野生型上，阻礙了變異引物與野生型基因的彡口口 依據本專利技術的引物設計方法設計的引物，可用于實時熒光PCR、PCR_ELISA、PCR-反向分子雜交、PCR-基因芯片分析等實驗中。與其他方法聯用，可開發多種基因變異檢測試劑盒。根據上述方法，本專利技術可以與實時熒光PCR技術設計各種用于基因變異檢測PCR試劑盒，其中包括dNTPs、二價本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測基因變異的PCR引物設計方法，包括：在基因同源和保守的區域設計正向PCR通用引物，所述正向PCR通用引物的5’端附加一段與基因變異區域野生型完全互補6~20個堿基的寡核苷酸；在變異基因的位置設計與變異基因完全互補的反向引物。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：樓敬偉，李丙亮，謝彩霞，
申請(專利權)人：上海寶藤生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：