窖泥細菌的鑒定方法技術

本發明專利技術屬于微生物領域，具體涉及窖泥細菌的鑒定方法。本發明專利技術要解決的技術問題是提供一種窖泥細菌的鑒定方法。本發明專利技術的技術方案是窖泥細菌的鑒定方法，包括如下步驟：1）獲得待測菌株；2）驗證待測菌株是否為純化菌株；3）采用Biolog全自動微生物鑒定儀對純的細菌菌株進行鑒定。本發明專利技術方法鑒定結果準確可靠，為窖泥細菌的鑒定提供了新的選擇，在釀酒領域具有重要的應用價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于微生物領域，具體涉及。
技術介紹
窖泥微生態系統是由厭氧異養菌、甲烷菌、已酸菌、乳酸菌、硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌等多種微生物組成的共生群落系統。“百年老窖”其實質是窖泥中富集了大量以細菌為主的多種微生物菌群，經過長期不斷的馴化及代謝產物的積累，產生了以已酸乙酯為主體的香氣成分，為濃香型白酒帶來了獨特風味。窖泥質量的好壞直接對酒質起關鍵性作用，因此窖泥微生態系統中的微生物的選育及鑒定，對新窖老熟及進一步培養出優質窖泥，提高濃香型白酒的產量和質量提供技術支撐。·MicroStation快速微生物鑒定儀,可鑒定超過2000種好氧菌、厭氧菌和酵母菌，還可以進行霉菌的鑒定。該系統為美國FDA認可，適用于任何規模的實驗室中，由于使用了方便的讀數儀，非常節省勞動力。自Biolog全自動微生物鑒定儀問世以來，在微生物的鑒定上發揮了重大作用。該儀器的原理是利用固定在微孔板上的不同生化試驗(檢測待鑒定微生物對眾多碳源的利用情況)對微生物提供表型概況并進行鑒定，Biolog鑒定系統MicroStation中的軟件通過讀取微孔板上所表現出的“表型指紋”被用來在種的水平上鑒定該微生物。采用Biolog全自動微生物鑒定儀鑒定時,純的培養物是鑒定的前提。在鑒定中最普遍的問題是技術人員可能沒有意識到他們獲得的并非純的培養物，而是混合培養物。如果需要鑒定的微生物不純，而該系統本身無提示性，且系統仍然把它當純種微生物對待，根據碳源的利用情況來判別就會給出錯誤的鑒定結果。窖泥中很多細菌能分泌粘液，具有粘性的表面，它們很容易和其它細菌緊緊的黏在一起，而窖泥中細菌種類繁多，通過一般的分離純化得到純的單菌株非常困難。白酒業是中國傳統產業，釀酒窖池中窖泥細菌的分離鑒定對于揭秘中國傳統白酒微量香味物質生成機理具有重大的現實意義。所以尋找一種快速、準確鑒定窖泥細菌的方法顯得尤為重要。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種。本專利技術的技術方案是，包括如下步驟I)獲得待測菌株無菌條件下，取窖泥于含有玻璃珠的滅菌水中，ISOrpm室溫振蕩30分鐘，按10倍的梯度將菌液稀釋到10_6，取各稀釋度的菌液接種到分離培養基中，37°C厭氧培養5 7天，得到單菌落；2)驗證待測菌株是否為純化菌株提取待測菌株的基因組DNA，擴增16s rDNA,將擴增結果測序，若測序結果沒有重疊峰，即得到純化的待測菌株，若測序結果有重疊峰，即進行二次純化，得到純的培養物；擴增引物的序列如SEQ ID No I和SEQ ID No 2所示；3)采用Biolog全自動微生物鑒定儀對純的細菌菌株進行鑒定。其中，步驟I)中分離培養基配方如下基礎培養基850mL/L，維生素溶液5mL/L，pH至6. O 6. 5 ;121°C高壓滅菌20min,冷卻至65°C,加入2%無水乙醇。其中，所述基礎培養基配方如下=KH2PO4L 5g/L，(NH4)2SO4O. 5g/L，醋酸鈉2. Og/L,酪蛋白氨基酸 O. 5g/L，蛋白胨 O. 5g/L，酵母膏 O. 5g/L，KCL I. 5g/L，FeCl2 · 4H20 O. 002g/L，CoCl2 · 6H20 0. 0002g/L, MnCl2 · 4H20 0. 00015g/L。其中，所述維生素溶液配方如下四氨基苯甲酸酯0. 05g/L，煙酸O. lg/L，VB50. lg/L, VB60. 15g/L，VB10. 15g/L ;濾膜過濾，_20°C保存。在分離培養基中添加維生素溶液能給很多難于培養的厭氧微生物帶來微量營養物質，使它們生長或是更好的生長，這樣分離效果更好。其中，步驟2)所述的二次純化包括如下操作無菌條件下，接種待純化菌株于含有玻珠的滅菌水中，180rpm室溫振蕩30分鐘，按10倍的梯度將菌液稀釋到10_6，取各稀釋度的菌液接種到二次純化培養基中，37°C厭氧培養5 7天，得到單菌落；所述二次純化培養基為在分離培養基中添加20%的窖泥浸出液和5%的脫脂羊血得到。其中，所述的窖泥浸出液的制備方法如下取20年以上窖齡的窖底泥，加水，小火煮30min,過濾,定容；定容比例為每50g窖底泥定容至1L。本專利技術方法鑒定結果準確可靠。在使用Biolog全自動微生物鑒定儀鑒定前，對待測菌株進行純化鑒定，以保證鑒定結果的準確性。本專利技術方法還針對窖泥細菌的特點，提出了專用的分離培養基，輔助提高鑒定效果。本專利技術為窖泥細菌的鑒定提供了新的選擇，在釀酒領域具有重要的應用價值。附圖說明圖I、16s rDNA擴增的瓊脂糖電泳圖，圖中M代表Marker (康為世紀公司，DM2000) 圖2、I號單菌落的16s rDNA擴增后測序峰3、2號單菌落的16s rDNA擴增后測序峰4、3號單菌落的16s rDNA擴增后測序峰5、4號單菌落的16s rDNA擴增后測序峰圖具體實施例方式本專利技術的，包括如下步驟I)獲得待測菌株無菌條件下，取窖泥于含有玻璃珠(其作用是為了有利于窖泥分散，使菌株從窖泥中溶到水中，玻璃珠的直徑約5mm)的滅菌水中，180rpm室溫振蕩30分鐘，按10倍的梯度將菌液稀釋到10_6，取各稀釋度的菌液接種到分離培養基中，37°C厭氧培養5 7天,得到單菌落；2)驗證待測菌株是否為純化菌株提取待測菌株的基因組DNA，擴增16s rDNA,將擴增結果測序，若測序結果沒有重疊峰，即得到純化的待測菌株，若測序結果有重疊峰，即進行二次純化，得到純的培養物；擴增引物為27F :AGAGT TTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID Nol)和 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT (SEQ ID No 2)。在DNA測序過程中,測定的是每一個堿基。DNA分子的每一位點對應一個堿基,這是通過測序儀器測定的每一峰值來確定該位點為何種堿基。若同一位點對應多個峰或者有交叉，即為重疊峰，則說明待測樣品中的DNA分子不純，從而導致同一位點測出多種堿基的峰值。在細菌中16s rDNA高度保守，若出現重疊峰則說明所擴增出來的16s rDNA不純，可能來自非同一菌株。3)采用Biolog全自動微生物鑒定儀對純的細菌菌株進行鑒定。其中，步驟I)中分離培養基配方如下基礎培養基850mL/L，維生素溶液5mL/L，pH至6. O 6. 5 ;121°C高壓滅菌20min,冷卻至65°C,加入2%無水乙醇。其中，所述基礎培養基配方如下=KH2PO4L 5g/L，(NH4)2SO4O. 5g/L，醋酸鈉2. Og/L,酪蛋白氨基酸 O. 5g/L，蛋白胨 O. 5g/L，酵母膏 O. 5g/L，KCL I. 5g/L，FeCl2 · 4H20 O. 002g/L，CoCl2 · 6H20 0. 0002g/L, MnCl2 · 4H20 0. 00015g/L。本專利技術中，根據窖泥細菌的特點，經過多次實驗，得到了現有的針對窖泥細菌分離的基礎培養基的配方。其中，所述維生素溶液配方如下四氨基苯甲酸酯O. 05g/L，煙酸O. lg/L,VB50. lg/L, VB60. 15g/L，VB10. 15g/L ;濾膜過濾，_20°C保存。在分離培養基中添加維生素溶液能給很多難于培養的厭氧微生物帶來微量營養物質，使它們生長或是更好的生長，這樣分離效果更本文檔來自技高網...

【技術保護點】
窖泥細菌的鑒定方法，其特征在于：包括如下步驟：1）獲得待測菌株：無菌條件下，取窖泥于含有玻璃珠的滅菌水中，180rpm室溫振蕩30分鐘，按10倍的梯度將菌液稀釋到10？6，取各稀釋度的菌液接種到分離培養基中，37℃厭氧培養5～7天，得到單菌落；2）驗證待測菌株是否為純化菌株；提取待測菌株的基因組DNA，擴增16s？rDNA，將擴增結果測序，若測序結果沒有重疊峰，即得到純化的待測菌株，若測序結果有重疊峰，即進行二次純化，得到純的培養物；擴增引物的序列如SEQ？ID？No？1和SEQ？ID？No？2所示；3）采用Biolog全自動微生物鑒定儀對純的細菌菌株進行鑒定。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：徐占成，唐清蘭，劉孟華，徐姿靜，樊科權，
申請(專利權)人：四川綿竹劍南春酒廠有限公司，
類型：發明
國別省市：