本發(fā)明專利技術(shù)屬免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于前列腺癌早期診斷的三組引物對(duì)、三個(gè)DNA探針和試劑盒。所述三組引物對(duì)分別具有SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:5以及SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:6所示的核苷酸序列。三個(gè)DNA探針在3’端均標(biāo)記有生物素，并且分別具有SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:8、SEQ?ID?NO:9所示的核苷酸序列，序列中*位置上的氨基酸自由基上接有發(fā)光基團(tuán)。所述前列腺癌早期診斷試劑盒含有上述三組引物對(duì)、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶以及其上涂布有抗生蛋白鏈菌素，且該抗生蛋白鏈菌素上接有上述DNA探針的固相載體。本發(fā)明專利技術(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)人體TMPRSS2:ERG、PCA3、PSA基因的表達(dá)水平，以判斷前列腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于前列腺癌早期診斷的引物對(duì)、探針和試劑盒。
技術(shù)介紹
前列腺癌是男性常見(jiàn)病和多發(fā)病。目前常用的前列腺癌早期診斷方法有直腸指診、超聲引導(dǎo)前列腺穿刺活檢和影像學(xué)診斷等，這些方法都存在一定的局限性，直腸指診是一種非特異的檢查方法，只能作為前列腺癌的一種篩查方法；部分穿刺活檢準(zhǔn)確性差，如組織用蘇木精-伊紅染色法檢測(cè)結(jié)果提示腫瘤為陰性而被診斷為前列腺良性病變的患者，實(shí)際卻患有前列腺癌；影像學(xué)診斷同樣存在缺陷，如磁共振成像的相關(guān)檢查技術(shù)費(fèi)用昂貴難以普及應(yīng)用，CT在前列腺癌的早期診斷上沒(méi)有特別突出的優(yōu)勢(shì)等。生物指標(biāo)的基因表達(dá)水平現(xiàn)已成為疾病診斷的新方向。臨床上最常用的前列腺癌腫瘤標(biāo)志物是血清前列腺特異抗原(PSA)，盡管血清PSA的檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)早期的前列腺癌，但是檢測(cè)血清PSA的方法特異性不高，特別是PSA值處于riOng/mL檢測(cè)灰區(qū)的病人，·活檢陽(yáng)性率僅有20. 4%。目前，前列腺癌抗原3基因(PCA3)被認(rèn)為是前列腺癌最特異的基因，它在正常前列腺組織中呈低表達(dá)，在前列腺腫瘤中表達(dá)量顯著增高，在其他正常組織、腫瘤組織中均不表達(dá)。另外還有跨膜絲氨酸蛋白酶2基因和成紅細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)化基因相關(guān)基因的融合基因(TMPRSS2:ERG)對(duì)診斷前列腺癌的特異性也很高，只是靈敏度偏低。當(dāng)前，對(duì)于前列腺癌生物指標(biāo)的基因表達(dá)水平的檢測(cè)正由對(duì)特異性不高的PSA基因表達(dá)水平的檢測(cè)轉(zhuǎn)向?qū)μ禺愋暂^高的PCA3、TMPRSS2:ERG等基因表達(dá)水平的檢測(cè)。但是最常用的仍是實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)，雖然RT-PCR的檢測(cè)靈敏度高，但對(duì)設(shè)備和診斷試劑要求比較苛刻，試劑成本比較高，而且需要具有專業(yè)技能的人員去操作并且解讀結(jié)果，普及性差。而且一般僅以單個(gè)生物指標(biāo)的表達(dá)水平作為前列腺癌診斷依據(jù)。這種單指標(biāo)診斷存在容易漏診或者誤判以及準(zhǔn)確度不高的問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的第一個(gè)目的是提供一種用于前列腺癌早期診斷的三組引物對(duì)，該三組引物對(duì)用于采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)人體跨膜絲氨酸蛋白酶2基因和成紅細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)化基因相關(guān)基因的融合(TMPRSS2: ERG)、前列腺癌抗原3 (PCA3)、血清前列腺特異抗原(PSA)基因的表達(dá)水平。該三個(gè)生物指標(biāo)聯(lián)合，可以提高前列腺癌早期診斷的準(zhǔn)確率，能克服僅檢測(cè)單個(gè)生物指標(biāo)的基因表達(dá)水平容易出現(xiàn)漏診或者誤判以及準(zhǔn)確率低的問(wèn)題。本專利技術(shù)解決以上技術(shù)問(wèn)題采取的技術(shù)方案是所述用于前列腺癌早期診斷的三組引物對(duì)，其第一組引物對(duì)具有SEQ IDN0:1和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；第二組引物對(duì)具有SEQ IDN0:2和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；第三組引物對(duì)具有SEQ IDN0:3和SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，所述三組引物對(duì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)來(lái)檢測(cè)人體體內(nèi)TMPRSS2:ERG、PCA3、PSA基因的表達(dá)水平，以判斷前列腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。本專利技術(shù)的第二個(gè)目的是提供用于前列腺癌早期診斷的三個(gè)DNA探針，用于采用固定化雜交保護(hù)法定量檢測(cè)TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA基因的表達(dá)水平，以提高前列腺癌早期診斷中生物指標(biāo)表達(dá)水平檢測(cè)的準(zhǔn)確性和操作的方便性。解決以上技術(shù)問(wèn)題采取的技術(shù)方案是所述前列腺癌早期診斷的三個(gè)DNA探針，在3’端均標(biāo)記有生物素，并且分別具有SEQ IDNO: 7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，且該SEQ IDNO: 7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列中*位置接有氨基酸自由基，并且該氨基酸自由基上接有發(fā)光基團(tuán)。上述發(fā)光基團(tuán)是吖啶酯。本專利技術(shù)的第三個(gè)目的是提供上述用于前列腺癌早期診斷的DNA探針的制備方法。解決以上技術(shù)問(wèn)題采取的技術(shù)方案是在3’端標(biāo)記有生物素、且具有SEQIDNO:7, SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列的DNA探針中*位置的氨基酸自 由基上接上發(fā)光基團(tuán)——吖啶酯，具體步驟如下 第一步，將吖啶酯溶于二甲基亞砜； 第二步，在水的參與下，溶有二甲基亞砜的吖啶酯與干燥的上述3’端標(biāo)記有生物素、且具有SEQ IDNO:7, SEQ ID N0:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的DNA探針在20 45° C、pH6 9條件下反應(yīng)20 60 min，再用賴氨酸中止反應(yīng)。第三步，加入醋酸鈉和糖原，混勻后加入無(wú)水乙醇，并在0° C以下反應(yīng)5 HiirTlOh，離心除去上清，保留沉淀物。第四步，沉淀物用水溶解后，用反相高效液相色譜純化。本專利技術(shù)的第四個(gè)目的是提供一種前列腺癌早期診斷試劑盒，該試劑盒能夠用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)和固定化雜交保護(hù)法快速地定量檢測(cè)人體體內(nèi)TMPRSS2:ERG和PCA3基因表達(dá)水平。由于TMPRSS2:ERG和PCA3基因均是前列腺癌特異性高的基因，因此利用該雙指標(biāo)聯(lián)合診斷早期前列腺癌能提高前列腺癌早期的診斷準(zhǔn)確率，而利用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)和固定化雜交保護(hù)法檢測(cè)TMPRSS2: ERG和PCA3基因的表達(dá)水平，需要以PSA基因的表達(dá)水平為基準(zhǔn)值，因此本試劑盒中也包括檢測(cè)人體體內(nèi)PSA基因表達(dá)水平的診斷試劑。解決以上技術(shù)問(wèn)題采取的技術(shù)方案是所述前列腺癌早期診斷試劑盒含有， 容器al，容器al中裝有用于檢測(cè)TMPRSS2:ERG基因表達(dá)水平的啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物具有SEQ IDNO: I所示的核苷酸序列； 容器a2，容器a2中裝有用于檢測(cè)TMPRSS2: ERG基因表達(dá)水平的反向引物，該反向引物具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； 容器b I，容器b I中裝有用于檢測(cè)PCA3基因表達(dá)水平的啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； 容器b2，容器b2中裝有用于檢測(cè)PCA3基因表達(dá)水平的反向引物，該反向引物具有SEQID N0:5所示的核苷酸序列； 容器c I，容器c I中裝有用于檢測(cè)PSA基因表達(dá)水平的啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； 容器c2，容器c2中裝有用于檢測(cè)PSA基因表達(dá)水平的反向引物，該反向引物具有SEQID N0:6所示的核苷酸序列； 容器d，容器d中裝有逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶的混合液；以及固相載體，該固相載體上涂有抗生蛋白鏈菌素，該抗生蛋白鏈菌素上接有上述標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針。上述固相載體可以是96孔板。上述試劑盒中還包括容器e，容器e中裝有由已知拷貝數(shù)的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA轉(zhuǎn)錄物組成的標(biāo)準(zhǔn)品。上述試劑盒中還包括容器f，容器f中裝有由已知拷貝數(shù)的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA轉(zhuǎn)錄物組成的對(duì)比品。上述試劑盒中還包括容器g，容器g中裝有mRNA提取液。上述試劑盒中還包括容器h，容器h中裝有雜交液。上述試劑盒中還包括容器i，容器i中裝有選擇液。 上述試劑盒中還包括容器j，容器j中裝有顯色液。該前列腺癌早期診斷試劑盒，利用的是轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)以及固定化雜交保護(hù)法。相比RT-PCR，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)可以在低溫下和一個(gè)試管內(nèi)進(jìn)行高拷貝地?cái)U(kuò)增TMPRSS2: ERG、PCA3 和 PSA 的 mRNA。擴(kuò)增出的 TMPRSS2: ERG、PCA3 和 PSA 的 m本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于前列腺癌早期診斷的三組引物對(duì)，其特征在于：第一組引物對(duì)具有SEQ？IDNO:1和SEQ？ID？NO:4所示的核苷酸序列；第二組引物對(duì)具有SEQ？IDNO:2和SEQ？ID？NO:5所示的核苷酸序列；第三組引物對(duì)具有SEQ？IDNO:3和SEQ？ID？NO:6所示的核苷酸序列，所述三組引物對(duì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)來(lái)檢測(cè)人體體內(nèi)TMPRSS2:ERG、PCA3、PSA基因的表達(dá)水平，以判斷前列腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：端鵬，葉欣，李博，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：端鵬，葉欣，李博，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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