本發明專利技術公開了一種用于鑒定或輔助鑒定小麥春化基因VRN-1的PCR體系及其應用。本發明專利技術PCR體系的引物對組由四個引物對組成；引物對1由序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成，引物對2由序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成，引物對3由序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成，引物對4由序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成。本發明專利技術所提供的PCR引物對組中各引物對之間不存在相互抑制作用和錯配，檢測品種的結果可靠、重復性好，成本低，且特異性強，檢測過程耗時短；本發明專利技術對檢測小麥品種的冬春性，進而提高育種的效率，加強對育種高代的選擇具有重要意義；另外，本發明專利技術使得在小麥推廣和引種過程中，有更強的目標性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種用于鑒定或輔助鑒定小麥春化基因VRN-I的PCR體系及其應用，特別涉及一種用于鑒定或輔助鑒定待測小麥春化基因VRN-I的多重PCR引物對組、試劑盒及其應用。
技術介紹
春化階段是小麥生長發育的基本階段之一。小麥的春化反應與其生育期及適應性密切相關，是指導小麥區劃和新品種推廣的主要依據之一，受春化基因控制。春化基因決定小麥全生育周期長短的7(T75%。Iwaki和Van Beem等研究表明，世界不同地區小麥品種的春化基因組成存在差異，反映了不同生態類型對品種春化反應的要求不同。 春化基因VRN-I編碼的蛋白為MADS-box轉錄因子，受低溫誘導促進開花，是普通小麥春化作用的一類主要基因，包括3個位點VRN-A1、VRN-Bl和VRN-D1，分別位于5A、5B和5D染色體長臂上。3個基因位點不同的等位變異對春化作用的效應不同，顯性等位變異Vm-Al的效應最強，表現為對春化作用高度不敏感，同時對Vrn-Bl和Vrn-Dl位點基因具有上位性效應；顯性等位變異Vrn-Bl和Vrn-Dl對春化作用的敏感性較弱，兩者之間未發現彼此間的上位作用。Yan和Fu等發現，VRN-I春化基因變異類型受其啟動子區和第一個內含子區決定。在普通小麥中，VRN-Al位點有4種變異類型，分別為Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn-Al，其中 Vrn-Ala、Vrn-Alb 和 Vrn-Alc 表現為顯性，vrn-Al 為隱性；VRN_B1 和 VRN-D1位點一般通常存在兩種等位變異類型，即顯性和隱性等位變異。與隱性等位變異類型相比，顯性等位變異Vrn-Ala和Vrn-Alb分別在啟動子區域插入和缺失了一定數量的堿基序列，而顯性Vrn-Alc、Vrn-Bl和Vrn-Dl在第一個內含子序列出現了大片段堿基的缺失。在普通小麥中，VRN-Al位點存在4種等位變異，需要用3對引物分別進行3次PCR檢測；VRN-B1和VRN-Dl位點兩種等位變異，需要用兩對引物分別進行兩次PCR檢測。為此，檢測I個小麥材料春化基因VRN-I的3個位點等位變異組成，需要連續進行7次PCR檢測，檢測程序繁瑣，實驗成本高。多重PCR這一概念自1988年由Chambercian等提出后，由于其快速、高效、低成本等一系列的優點，使得這項技術在生命科學領域得到了廣泛的應用，如植物種質純度鑒定、植物分子育種、植物病蟲害檢測等。利用多重PCR技術，在同一個PCR反應體系中加入兩對或兩對以上特異性引物進行擴增，可以同時檢測出多個等位變異類型，降低檢測成本，提高效益。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供用于鑒定或輔助鑒定待測小麥春化基因的多重PCR引物對組、試劑盒，以及利用所述多重PCR引物對組鑒定或輔助鑒定待測小麥春化基因的方法。本專利技術所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測小麥春化基因的多重PCR引物對組，具體由特異于VRN-Al基因的兩個引物對、特異于VRN-Bl基因的一個引物對和特異于VRN-Dl基因的一個引物對組成。所述特異于VRN-Al基因的兩個引物對分別為序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1，以及序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2 ；所述特異于VRN-Bl基因的一個引物對為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3 ;所述特異于VRN-Dl基因的一個引物對為序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4。其中，序列I由20個核苷酸組成；序列2由20個核苷酸組成；序列3由20個核苷酸組成；序列4由20個核苷酸組成；序列5由20個核苷酸組成；序列6由22個核苷酸組成；序列7由21個核苷酸組成；序列8由19個核苷酸組成。 本專利技術中，所述VRN-Al基因有四個等位基因，分別是Vrn-Ala、Vrn-Alb, Vrn-Alc和vrn-Al (前三個表現為顯性，最后一個表現為隱性)；所述VRN-Bl基因有兩個等位基因，分別是Vrn-Bl和vrn_Bl (前一個表現為顯性，后一個表現為隱性)；所述VRN-Dl基因有兩個等位基因，分別是Vrn-Dl和vrn-Dl (前一個表現為顯性，后一個表現為隱性)。所述引物對組中，所述序列I、所述序列2、所述序列3、所述序列4、所述序列5、所述序列6、所述序列7和所述序列8共八條單鏈DNA在PCR反應體系中的摩爾比可為3. 2^4 3.2 4 :2 2. 5 :2 2. 5 :3 3. 5 :3 3. 5 2. 5 3 2. 5 3。在本專利技術的一個實施例中，所述引物對組中，所述序列I、所述序列2、所述序列3、所述序列4、所述序列5、所述序列6、所述序列7和所述序列8共八條單鏈DNA在PCR反應體系中的摩爾比具體為3. 2 :3. 2 2 2 3 3 :2. 5 :2. 5。含有所述引物對組的試劑盒也屬于本專利技術的保護范圍。所述引物對組的制備方法也屬于本專利技術的保護范圍。該引物對組的制備方法可包括將所述引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。所述試劑盒的制備方法也屬于本專利技術的保護范圍。該試劑盒的制備方法可包括如下步驟將所述引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種包裝在同一試劑盒內PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。鑒定或輔助鑒定待測小麥含有Vrn-Ala、Vrn-Alb, Vrn-Alc和vrn-Al這四種基因中哪一種、含有Vrn-Bl和vrn_Bl這兩種基因中哪一種，以及含有Vrn-Dl和vrn_Dl這兩種基因中哪一種的方法也屬于本專利技術的保護范圍。該方法具體可包括如下步驟(I)以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對組進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為61 °C ；(2)檢測步驟(I)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測小麥含有Vrn-Ala、Vrn-Alb, Vrn-Alc和vrn-Al這四種基因中哪一種、含有Vrn-Bl和vrn-Bl這兩種基因中哪一種，以及含有Vrn-Dl和vrn_Dl這兩種基因中哪一種若所述PCR產物中同時含有715bp和624bp的兩個DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有Vrn-Ala基因；若所述PCR產物中含有473bp的DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有Vrn-Alb基因；若所述PCR產物中含有493bp的DNA片段、同時不含有1068bp的DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有Vrn-Alc基因；若所述PCR產物中同時含有493bp和1068bp的兩個DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有vrn-Al基因；若所述PCR產物中含有1149bp的DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有vrn-Bl基因；若所述PCR產物中不含有1149bp的DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有Vrn-Bl基因；若所述PCR產物中含有1671bp的DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有Vrn-Dl基因；若所述PCR產物中不含有1671bp的DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有vrn-Dl基因。本專利技術的另一個目的是提供一種培育冬性小麥品種的方法。所述冬性小麥品種對溫度要求極為敏感，春化階段適宜溫度在O 5°C，需經歷30 50天，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
用于鑒定或輔助鑒定待測小麥春化基因的多重PCR引物對組，所述小麥春化基因為VRN？A1基因、VRN？B1基因和VRN？D1基因，其特征在于：所述多重PCR引物對組由特異于所述VRN？A1基因的兩個引物對、特異于所述VRN？B1基因的一個引物對，以及特異于所述VRN？D1基因的一個引物對組成；所述特異于VRN？A1基因的兩個引物對分別為序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1，以及序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2；所述特異于VRN？B1基因的一個引物對為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3；所述特異于VRN？D1基因的一個引物對為序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：穆培源，張曉科，相吉山，張影全，桑偉，徐紅軍，韓新年，聶迎彬，崔鳳娟，鄒波，
申請(專利權)人：新疆農墾科學院，
類型：發明
國別省市：
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