本發明專利技術屬于一種對沙門氏菌進行快速分子分型判斷的試劑盒，具體地說是用試劑盒中的F0F1-ATPase分子馬達生物傳感器Chro-invA、Chro-hut、Chro-spvR、Chro-sdf對沙門氏菌的屬特異性基因invA、hut，毒性質粒基因spvR和腸炎沙門氏菌種特異性基因sdf進行檢測，從而對沙門氏菌是否攜帶毒性質粒以及是否為腸炎沙門氏菌進行分型判斷。第一，對屬特異性基因invA、hut的檢測可以對目標菌進行鑒定；第二，對spvR的檢測可以對目標菌是否攜帶毒性質粒做出判斷；第三，對sdf的檢測可以對目標菌是否為腸炎沙門氏菌做出判斷。方法包括試劑盒中F0F1-ATPase分子馬達生物傳感器的構建、用F0F1-ATPase分子馬達生物傳感器進行分子分型，最后根據分型結果對沙門氏菌是否攜帶毒性質粒以及是否為腸炎沙門氏菌進行分型判斷。其優點在于靈敏度高、快速、操作簡單、成本低廉。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于一種對沙門氏菌進行快速分子分型判斷的試劑盒，具體地說是用試劑盒中的 FtlF1-ATPase 分子馬達生物傳感器 Chro-invA、Chro-hut、Chro-spvR、Chro_sdf 對沙門氏菌(Salmonella)的屬特異性基因invA、hut，毒性質粒基因spvR和腸炎沙門氏菌種特異性基因sdf進行檢測，從而對Salmonella是否攜帶毒性質粒以及是否為腸炎沙門氏菌進行分型判斷。
技術介紹
Salmonella是自然界普遍存在的一種致病菌，在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病例占第一位或第二位。它引起的疾病主要分為兩大類一類是傷寒等烈性傳染病，另一類是急性腸胃炎。常見的肉類食品和奶蛋類食品都可以被沙門氏菌污染，其中鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等是常見的污染菌，它們是引起人類沙門氏菌食物中毒的主要致病菌，已對食品安全構成了嚴重威脅。Salmonella致病性的分子機制，目前的研究主要涉及Salmonella的毒力相關基因，包括 inv、hut、stn、spv、fim、hilA 等。沙門氏菌的侵襲蛋白(invasion protein, inv)是研究的熱點，該蛋白決定細菌進入宿主上皮細胞的能力，與沙門菌的致病性密切相關，侵襲蛋白是由inv基因簇(invA、invB、invC、invD和invE等一組基因)編碼,其中invA為沙門氏菌的主要毒力因子。研究表明invA基因是沙門氏菌A E群高度保守基因，對人類致病的沙門氏菌99%屬A至E群。且invA基因編碼吸附和侵襲上皮細胞表面的蛋白，該蛋白決定沙門氏菌對腸粘膜細胞的侵襲力，invA基因適合致病性沙門氏菌的檢測，但作為沙門氏菌屬特異性基因有一定的確定，有漏檢的可能。hut為編碼組氨酸操縱子基因，高度保守。stn為編碼腸毒素的基因。在不同血清型沙門氏菌的毒性質粒中存在一個IOkb左右高度保守區域，毒性區域位于一個8. 2kb片段中，具有一個操縱子和5個編碼基因(spvR，spvA, spvB, spvC, spvD)。spy基因編碼與沙門氏菌毒性質粒相關的毒力因子，與沙門氏菌的致病性有關。Fim是編碼菌毛的基因，是沙門氏菌中高度保守的屬特異基因。Hil是侵襲基因正調節蛋白的編碼基因。上述基因常用于Salmonella的PCR檢測鑒定。另外sdf基因作為腸炎沙門氏菌的種特異性基因常用于腸炎沙門氏菌的PCR檢測鑒定。 為了便于進行臨床診斷、流行病學調查、食品中微生物檢測及醫院感染監控，微生物的分型與檢測研究是必不可少的內容。目前，隨著分子生物學的發展以及與流行病學的密切結合，分子分型技術以其敏感性高、特異性強、分型率和分辨率高等優點，在流行病學調查、食物中毒的預警和溯源、食源性疾病的診斷以及微生物的檢測等方面發揮了重要的作用，并逐步替代了傳統的生化分型和血清學分型技術，如重復序列PCR(rep-PCR)、隨機擴增多態性DNA分析技術(RAPD)、限制性片段長度多態性分析(RFLP)、多位點序列分析(MLST)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)等。然而，上述方法操作起來都比較繁瑣，程序比較復雜。因此，在上述分子分型方法的優點基礎上，開發一種操作簡便、價格低廉的分子分型方法將具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術以Salmonella屬特異性基因invA、hut,毒性質粒基因spvR和腸炎沙門氏菌種特異性基因sdf為靶基因設計4個探針，通過“ ε亞基抗體-鏈霉素-生物素-探針”系統將探針與FtlF1-ATPase分子馬達連接構建FtlF1-ATPase分子馬達生物傳感器，進而與相應輔助試劑配套構建分子馬達生物傳感器分子分型試劑盒，從而對Salmonella是否攜帶毒性質粒以及是否為腸炎沙門氏菌進行分型判斷，從而建立Salmonella的分子馬達分子分型方法，為Salmonella的快速分型和溯源提供技術基礎。本專利技術所采用的技術方案為以Salmonella屬特異性基因invA、hut,毒性質粒基因spvR和腸炎沙門氏菌種特異性基因sdf靶基因設計4個探針，首先將生物素標記的ε亞基抗體結合在FtlF1-ATPase的ε亞基上，然后用鏈霉親和素(Sti^ptavidin)與ε亞基抗體上的生物素結合，最后將生物素標記的探針與鏈霉親和素結合，構建FtlF1-ATPase分子馬達生物傳感器，對目標Salmonella的DNA進行檢測,從而對Salmonella是否攜帶毒性質粒以及是否為腸炎沙門氏菌進行分型判斷。一方面，對屬特異性基因invA、hut的檢測可以對目標菌進行鑒定；另一方面，對spvR和sdf的檢測可以對目標菌是否攜帶毒性質粒以及是否為腸炎沙門氏菌做出判斷。利用FtlF1-ATPase作為載體對目標物進行檢測具有快速、靈敏度高、特異性強的特點。在FtlF1-ATPase分子馬達上連接特異的核酸探針，可以實現對目標基因快速、高特異性、高通量的檢測。本專利技術涉及的Salmonella的分子馬達生物傳感器分子分型試劑盒，包括以下試劑沙門氏菌分子分型試劑盒組成權利要求1.一種基于分子馬達生物傳感器技術的沙門氏菌(Salmonella)分子分型試劑盒，其特征在于包括以下組分 副溶血性弧菌分子分型試劑盒組成2.根據權利要求I所述的Salmonella的分子馬達生物傳感器分子分型試劑盒，其特征在于分子馬達生物傳感器的構建，包括 (1)載色體(Chromatophore)的制備 從玫瑰紅嗜熱菌(Thermomicrobium roseum)中提取載色體，FtlF1-ATPase存在于載色體上。FtlF1-ATPase—般由8個亞基組成，分別為α3β3γ δ ε ab2cn，是一種可旋轉分子馬達。 (2)F-DHPE標記載色體 F-DHPE是一種脂染料探針，可以嵌入到磷脂分子層中。同時F-DHPE也是一種pH指示劑，將其嵌入磷脂雙分子層可以用來測量磷脂層外面的PH變化。在pH7. 0-9. O范圍內，F-DHPE的熒光強度與pH值呈正相關。本專利技術將F-DHPE標記到分子馬達載色體磷脂分子層中用以指示FtlF1-ATPase合成ATP的效率。(3)生物素標記ε亞基抗體 用生物素(biotin-AC5-Sulfo_0s)標記ε亞基抗體N端。(4)探針合成及標記 以Salmonella屬特異性基因invA、hut,毒性質粒基因spvR和腸炎沙門氏菌種特異性基因sdf為模板設計探針，并用生物素(biotin-AC5-Sulfo-0s)標記探針5’端。一方面，對屬特異性基因invA和hut的檢測可以對目標菌進行鑒定；另一方面，對spvR和sdf的檢測可以對目標菌是否攜帶毒性質粒以及是否為腸炎沙門氏菌做出判斷。探針序列如下表3.根據權利要求I所述的Salmonella的分子馬達生物傳感器分子分型試劑盒，應用其進行分子分型，其特征是依次包括以下步驟 (1)細菌的培養及DNA的提取 (2)用分子馬達生物傳感器進行分子分型 ①取4個I.5mL EP管，各加入待測樣本10 μ L。將EP管放入沸水浴中加熱3min，然后立即轉移到冰上至完全冷卻； ②分別取2 μ L Chro-invA、Chro_hut、Chro-spvR、Chro-sd本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于分子馬達生物傳感器技術的沙門氏菌(Salmonella)分子分型試劑盒，其特征在于包括以下組分：副溶血性弧菌分子分型試劑盒組成
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張捷，周琦，王靜，盧曉宇，李兆杰，張惠媛，齊瑋，劉巖，汪琦，張昕，陳廣全，王小晉，王佩榮，樂加昌，
申請(專利權)人：北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，威海出入境檢驗檢疫局，
類型：發明
國別省市：
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