用于檢測人類紅細胞Diego血型基因分型的引物組及試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了一種用于檢測人類紅細胞Diego血型基因的引物組及試劑盒。用于Diego血型基因測定的引物組包括Dia引物對，Dib引物對及內參引物對。本發明專利技術的試劑盒克服了血清學方法鑒定Diego血型的種種限制、是正確判定血型不可缺少的輔助手段，具有廣泛的應用前景和臨床參考價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，特別涉及一種用于檢測人類紅細胞Diego血型基因分型的試劑盒（PCR-SSP法）。
技術介紹
傳統的Dia和Dib相應的ISBT符號為DI1和DI2,這是Diego血型系統中最具有臨床意義的一對抗原.Diego血型系統抗原相應的抗-Dia可以引起新生兒溶血病,也可以破壞輸入的Dia抗原紅細胞,抗-Dib非常罕見,但同樣能引起新生兒溶血病(HDN)和溶血性輸血反應,具有臨床意義,Dia和Dib抗原可以用血清學方法鑒定,但試劑較為昂貴,特別是抗-Dib定型試劑,市場上更是難以購買,且臨床因產生抗-Dib所引起的輸血問題,尋找相合的血源是非常困難的,我國隨機人群中調查DI1基因頻率為0.0357,DI2基因頻率為0.9643,Di(a+b-)表現型的人低于千分之一,因此,我們建立了Diego血型基因分型技術,并用于臨床Diego血型的鑒定,以及Di(a+b-)獻血人員的篩檢。Diego在1955年被發現，它因第一個產生抗新血型系統抗原的病人而命名，這個病人生下了一個患有新生兒溶血病的嬰兒，在其血清中發現了一種抗體（現稱為anti-Dia），這種抗體可以在懷孕期間通過胎盤屏障攻擊胎兒（表達Dia抗原）的紅細胞在1967，第二個diego抗原（Dib）被發現，直到1995其他的diego抗原相繼被發現。現今已經發現了21種diego抗原，但以Dia和Dib最為重要，它是決定一個人diego血型的關鍵因素。Anti-Dia和anti-Dib既可以引起新生兒溶血病又可以引發輸血不良反應，特別是新生兒溶血病在東南亞和南美普遍是由diego抗體所引起的，因此，通過對diego血型的深入研究可以預防新生兒溶血病和因diego血型不合而引起的輸血不良反應的發生。對實現安全輸血有重要的意義。
技術實現思路
本專利技術的目的是：克服血清學檢測試劑的價格昂貴，試劑不好購買等不足，提供一種免疫學方法能夠簡單方便的檢測人類紅細胞Diego血型基因的引物組。本專利技術的第二個目的是提供一種具有靈敏、特異、經濟、簡便、快速的用于檢測人類紅細胞Diego血型基因的試劑盒。一種用于檢測人類紅細胞Diego血型基因的引物組，其特征是包括Dia引物對，Dib引物對及內參引物對。所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EXON18?2541-2561和Intron18?203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EXON18?2541-2561和Intron18?203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。一種用于檢測人類紅細胞Diego血型基因的試劑盒，其特征是包括包被有Dia引物對，Dib引物對及內參引物對的引物板和濃縮dNTP-Buffer。所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EXON18?2541-2561和Intron18?203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EXON18?2541-2561和Intron18?203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。附圖說明圖?1為人類紅細胞Diego血型基因特異引物孔位圖。圖?2為實驗結果陰陽性判讀圖。圖?3?為人類紅細胞Diego血型基因測定結果分型讀板紙。圖?4?為人類紅細胞Diego血型基因測定試劑盒Diego電泳結果膠圖。具體實施方案下面結合具體實施例對本專利技術做進一步說明。實施例1。依據美國國立生物技術信息中心基因庫（NCBI?Gene?Bank）公開的Diego等位基因序列，設計出用于檢測人類紅細胞Diego血型基因的引物組，該引物組包括Dia引物對，Dib引物對及內參引物對。實施例2。一種用于檢測人類紅細胞Diego血型基因的試劑盒，包括包被有Dia引物對，Dib引物對及內參引物對的引物板和濃縮dNTP-Buffer。用于檢測人類紅細胞Diego血型基因的試劑盒的制備方法是：(1)????依據人類紅細胞Diego血型基因特異引物孔位圖（見圖1），分別將Dia引物對，Dib引物對及內參引物對包被至引物板的相應位置上，干燥處理；(2)????依據配220mM?dNTP、3.5mM?Mg2+、500mM?KCL、100mM?Tris-HCL、1%?TritonX-100制備出440μl?濃縮dNTP-Buffer；(3)????將包被有引物對的引物板每人份檢測包括2孔特異性引物孔，濃縮dNTP-Buffer組成一種用于檢測人類紅細胞Diego血型基因的試劑盒。實施例3。使用操作流程。一、2.5%瓊脂糖凝膠的準備。1.?將加入2.5g瓊脂糖加入100ml?1×TBE?溶液（Tris-硼酸鹽-EDTA溶液），加熱直到形成均勻的凝膠溶液。再加入適量電泳染色劑，混合均勻。2.?將凝膠槽置于水平位置，向凝膠槽中加入適量凝膠溶液，插入電泳梳。前后水平移動凝膠槽，確保凝膠溶液覆蓋均勻。3.?待凝膠完全凝固后，豎直拔出電泳梳。二、PCR循環參數見表1。??表1?擴增參數特征表。196℃/2min1cycle296℃/20sec,68℃/60sec5cycles396℃/20sec,65℃/45sec,72℃/30sec10cycles496℃/20sec,62℃/45sec,72℃/30sec15cycles572℃/3min1cycle64℃保存?三、必須滿足的試驗條件。1.??從冷凍室取出Taq聚合酶，放置冰上備用。2.???根據實驗所需數量，將包被引物的干燥冷凍保存的引物板取出，放置室溫解凍，備用。3.???根據實驗所需數量，將冷凍的DNA樣本、濃縮dNTP-Buffer取出，徹底融化，混勻離心。四、實驗過程中的注意事項。1.??PCR擴增前后使用的加樣器具要分開，不得混用。2.???所有血液制品均應按照潛在的傳染物處理。3.??當觀察和拍攝膠凝體時，要戴防紫外光的保護鏡，不要直視紫外光源。4.??試劑和樣本應加樣到微孔板的底部。5.???為避免交叉污染，在不同樣本和試劑之間要更換加樣槍頭。6.???在檢測前應準備好所有試劑和樣本，一旦開始試驗，為確保得到可靠結果不可中斷操作。7.??Taq聚合酶粘性很大，在分裝過程中必須小心操作確保準確。8.???嚴格按照指定的順序操作。五、操作步驟。?1.??選用實施例2制備的一種用于檢測人類紅細胞Diego血型本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測人類紅細胞Diego血型基因的引物組，其特征是包括Dia引物對，Dib引物對及內參引物對；所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EXON18?2541?2561和Intron18?203?223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列；所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EXON18?2541?2561和Intron18?203?223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。

【技術特征摘要】
1.一種用于檢測人類紅細胞Diego血型基因的引物組，其特征是包括Dia引物對，Dib引物對及內參引物對；
所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EXON18?2541-2561和Intron18?203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列；
所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA參考序列的EXON18?2541-2561和Intron18?203-223位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。
2.一種用于檢測人類...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙衛軍，
申請(專利權)人：天津市秀鵬生物技術開發有限公司，
類型：發明
國別省市：天津;12