高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白及其制造方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其為由轉(zhuǎn)化細(xì)胞所產(chǎn)生的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，該轉(zhuǎn)化細(xì)胞是將包含編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞而得到的，其中，宿主細(xì)胞來(lái)源的蛋白質(zhì)含量比率為相對(duì)于10,000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于10ng。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白及其制造方法
本專利技術(shù)涉及高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白及其制造方法。
技術(shù)介紹
血栓調(diào)節(jié)蛋白作為具有通過(guò)與凝血酶特異性結(jié)合來(lái)阻斷凝血酶的血液凝固活性并同時(shí)顯著促進(jìn)凝血酶的蛋白質(zhì)C活化能力的作用的物質(zhì)而為人所知，并已知其具有強(qiáng)力的血液凝固阻斷作用。已知其延長(zhǎng)基于凝血酶作用的凝固時(shí)間、抑制基于凝血酶的血小板聚集。蛋白質(zhì)C為在血液凝固纖溶系統(tǒng)中起到重要作用的維生素K依賴性蛋白質(zhì)，在凝血酶的作用下被活化，成為活化蛋白C。已知該活化蛋白C在生物體內(nèi)使血液凝固系統(tǒng)因子的活性型第V因子以及活性型第VIII因子失活，并且還與具有血栓溶解作用的纖溶酶原激活劑的產(chǎn)生相關(guān)(非專利文獻(xiàn)1)。因此認(rèn)為，血栓調(diào)節(jié)蛋白利用該凝血酶來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)C的活化，作為抗血液凝固劑或血栓溶解劑是有用的，另外還有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)告指出血栓調(diào)節(jié)蛋白在伴隨凝固亢進(jìn)的疾病的治療、預(yù)防中是有效(非專利文獻(xiàn)2)。以往，血栓調(diào)節(jié)蛋白是作為在以人為首的各種動(dòng)物種的血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的糖蛋白質(zhì)而被發(fā)現(xiàn)獲得的，其后成功進(jìn)行克隆化。即，利用基因工程方法，從人肺cDNA文庫(kù)中對(duì)含有信號(hào)肽的人血栓調(diào)節(jié)蛋白前體的基因進(jìn)行克隆，并且對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白的全基因序列進(jìn)行解析，明確了含有信號(hào)肽(通常示例出18個(gè)氨基酸殘基)的575個(gè)殘基的氨基酸序列(專利文獻(xiàn)1)。信號(hào)肽被切斷的成熟血栓調(diào)節(jié)蛋白由以下5個(gè)區(qū)域構(gòu)成：從其成熟肽的N末端側(cè)起的N末端區(qū)域(1-226號(hào)：表示在認(rèn)可信號(hào)肽為18個(gè)氨基酸殘基時(shí)的位置，下同)、具有6個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域(227-462號(hào))、O型糖鏈增加區(qū)域(463-498號(hào))、膜貫通區(qū)域(499-521號(hào))、以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域(522-557號(hào))，并且作為與全長(zhǎng)血栓調(diào)節(jié)蛋白具有相同活性的部分(即最小活性單元)，已知為在具有6個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域之中的主要由從N末端側(cè)起的第4、5、6號(hào)EGF樣結(jié)構(gòu)構(gòu)成的部分(非專利文獻(xiàn)3)。全長(zhǎng)的血栓調(diào)節(jié)蛋白如果沒(méi)有表面活性劑的存在則難以溶解，作為制劑必須添加表面活性劑，與此相對(duì)，存在即使在沒(méi)有表面活性劑的情況下也能很好地發(fā)生溶解的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。只要使可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白至少不含有膜貫通區(qū)域的一部分或全部來(lái)進(jìn)行制備即可，例如，僅由N末端區(qū)域、具有6個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域和O型糖鏈增加區(qū)域這3個(gè)區(qū)域構(gòu)成(即，由序列編號(hào)1的第19～516位氨基酸序列構(gòu)成)的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白可通過(guò)應(yīng)用重組技術(shù)來(lái)獲得，并且確認(rèn)到該重組體可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白具有天然的血栓調(diào)節(jié)蛋白的活性(專利文獻(xiàn)1)。此外作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的例子也有一些報(bào)告(專利文獻(xiàn)2～9)。另外作為天然型也舉出了人尿來(lái)源的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白等(專利文獻(xiàn)10、11)。順便提及，在基因中，通過(guò)自然的變異或取得時(shí)的變異，如多數(shù)情況所確認(rèn)的那樣，在人中也發(fā)現(xiàn)了多形性變異，上述的由575個(gè)殘基的氨基酸序列構(gòu)成的人血栓調(diào)節(jié)蛋白前體的第473位氨基酸為Val的和為Ala的是現(xiàn)在所確認(rèn)的。在編碼該氨基酸的堿基序列中，分別相當(dāng)于在第1418位上有T變異和C變異(非專利文獻(xiàn)4)。但是，在活性和物性方面是完全無(wú)差異的，可判定兩者實(shí)質(zhì)上相同。有報(bào)告指出血栓調(diào)節(jié)蛋白在DIC的治療中是有效的(非專利文獻(xiàn)5、6)。作為血栓調(diào)節(jié)蛋白的用途，除了上述以外，還期待其用于例如下述疾病的治療和預(yù)防：急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)、血栓癥、末梢血管閉塞癥、閉塞性動(dòng)脈硬化癥、血管炎、心臟手術(shù)的繼發(fā)性功能性障礙、臟器移植的并發(fā)癥、心絞痛、暫時(shí)性腦缺血發(fā)作、妊娠中毒癥、糖尿病、肝VOD(Liverveno-occlusivedisease；急性肝炎和骨髓移植后的肝靜脈閉塞癥)、深部靜脈血栓癥(DVT；Deepvenousthrombosis)等；以及成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS；Adultrespiratorydistresssyndrome)。以考慮到在藥品中的應(yīng)用為前提，需要大量地且以更低成本來(lái)制造可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，這自不消說(shuō)，但有文獻(xiàn)指出，來(lái)源于制造工序的異種蛋白質(zhì)(例如宿主細(xì)胞來(lái)源的蛋白質(zhì)、培養(yǎng)基來(lái)源的牛血清蛋白、抗體柱來(lái)源的小鼠IgG等)具有免疫原性，從安全性方面考慮可能有問(wèn)題(非專利文獻(xiàn)7)。考慮到在藥品中的應(yīng)用，作為以工業(yè)水平制造可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的方法，例如已知有采用擔(dān)載有針對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白的抗體的親和柱色譜法作為主精制工序的方法；進(jìn)一步已知有下述高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造方法，其為實(shí)質(zhì)上不含有血清來(lái)源物和抗體來(lái)源物的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造方法，該制造方法的特征在于，將通過(guò)親和色譜法得到的該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白在電導(dǎo)率為25ms/cm～34ms/cm、pH為3～4的條件下與陽(yáng)離子交換體接觸，在該工序中，以流通級(jí)分(素通り畫分)的形式得到該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(專利文獻(xiàn)12)。還已知有在主精制工序的親和柱色譜法工序之后組合強(qiáng)陰離子交換柱色譜法的精制方法(專利文獻(xiàn)13)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：日本特開(kāi)昭64-6219號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2：日本特開(kāi)平2-255699號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3：日本特開(kāi)平3-133380號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4：日本特開(kāi)平3-259084號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5：日本特開(kāi)平4-210700號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6：日本特開(kāi)平5-213998號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7：WO92/00325號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)8：WO92/03149號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)9：WO93/15755號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)10：日本特開(kāi)平3-86900號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)11：日本特開(kāi)平3-218399號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)12：日本特開(kāi)平11-341990號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)13：WO2008/117735號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1：鈴木宏治，醫(yī)學(xué)のあゆみ(醫(yī)學(xué)進(jìn)展)，第125卷，901頁(yè)(1983年)非專利文獻(xiàn)2：K.Gomi等，Blood75.1396-1399(1990)非專利文獻(xiàn)3：M.Zushi等，J.Biol.Chem.,264,10351-10353(1989)非專利文獻(xiàn)4：D.Z.Wen等，Biochemistry,26,4350-4357(1987)非專利文獻(xiàn)5：S.M.Bates等，Br.J.Pharmacol.,144,1017-1028(2005)非專利文獻(xiàn)6：H.Saito等，J.ThrombHaemost,5(1),31(2007)非專利文獻(xiàn)7：早川堯夫，バイオ醫(yī)薬品の開(kāi)発と品質(zhì)·安全性確保(生物藥品的開(kāi)發(fā)與品質(zhì)-安全性確保)，273-274(2007)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
專利技術(shù)所要解決的課題本專利技術(shù)的課題在于提供宿主細(xì)胞來(lái)源的蛋白質(zhì)濃度比率為相對(duì)于10,000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于10ng的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白及其制造方法。解決課題的手段在專利文獻(xiàn)13中記載了經(jīng)精制的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。特別是在該文獻(xiàn)的實(shí)施例14中公開(kāi)了宿主來(lái)源的蛋白質(zhì)(以下，在本說(shuō)明書中也簡(jiǎn)稱為“HCP”)的濃度被記為“N.D.”(盡管未明確記載，但認(rèn)為其意味著“未檢出”)的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。看到該記載的本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)為已經(jīng)充分實(shí)現(xiàn)了HCP的混入得以降低的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，也就不會(huì)想到試圖降低可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中的HCP，即試圖降低可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中HCP的混入的動(dòng)機(jī)等通常是不存在的。但是，本專利技術(shù)人強(qiáng)烈認(rèn)識(shí)到如下重大問(wèn)題：在將精制的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白作本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】2010.04.30 JP 2010-1054211.一種高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其為由轉(zhuǎn)化細(xì)胞所產(chǎn)生的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，該轉(zhuǎn)化細(xì)胞是將編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞而得到的，其中，宿主細(xì)胞來(lái)源的蛋白質(zhì)含量比率為相對(duì)于10,000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于10ng且為0.001ng以上，該宿主細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。2.如權(quán)利要求1所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為通過(guò)對(duì)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)而產(chǎn)生的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。3.如權(quán)利要求1或2所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為具有下述(1)～(5)的性質(zhì)的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白：(1)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用；(2)促進(jìn)基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用；(3)延長(zhǎng)基于凝血酶的凝固時(shí)間的作用；(4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及(5)抗炎作用。4.如權(quán)利要求1或2所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的分子量為50,000至80,000的范圍。5.如權(quán)利要求1或2所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白是通過(guò)包括以下工序的方法制造的：(a)將編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞的工序；(b)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液的工序；以及(c)使該含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸，得到高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的工序，該高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中，宿主細(xì)胞來(lái)源的蛋白質(zhì)含量比率為相對(duì)于10,000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于10ng。6.如權(quán)利要求1或2所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為下述可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白：其為序列編號(hào)9或序列編號(hào)11的任一項(xiàng)所記載的氨基酸序列中的第19～516位氨基酸序列的肽。7.如權(quán)利要求1或2所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：上野雄二，重松弘樹(shù)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：旭化成制藥株式會(huì)社，
類型：
國(guó)別省市：