PCR用引物對、PCR用反應(yīng)液以及食物中毒菌的檢測方法技術(shù)

一種PCR用引物對，其特異性擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌、彎曲菌、大腸桿菌、李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌中的兩種以上的食物中毒菌的核酸。由此，可以同時(shí)且特異性地檢測出這些食物中毒菌。使用由如下引物對之中的兩個以上的引物對組成的PCR用引物對，利用PCR法，對食物中毒菌的核酸進(jìn)行特異性擴(kuò)增，所述引物對包括：用于蠟樣芽孢桿菌檢測的序列編號1和2、序列編號3和4的引物對；用于彎曲菌檢測的序列編號5和6的引物對；用于大腸桿菌檢測的序列編號7和8的引物；用于李斯特菌檢測的序列編號9和10的引物對、用于沙門氏菌檢測的序列編號11和12的引物對；用于金黃色葡萄球菌檢測的序列編號13和14的引物對；用于副溶血弧菌檢測的序列編號15和16的引物對。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及一種用于檢測食物中毒菌的PCR用引物對，特別是涉及能夠特異性地檢測多種食物中毒菌的PCR用引物對、PCR用反應(yīng)液、食物中毒菌的檢測方法。
技術(shù)介紹
以往，在食品檢查或環(huán)境檢查、臨床試驗(yàn)、家畜衛(wèi)生等方面上，進(jìn)行是否存在食物中毒菌的檢查。在這樣的檢查中，近年來進(jìn)行如下操作利用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，將檢查試樣中所包含的DNA(脫氧核糖核酸)擴(kuò)增，并基于所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，判定對象菌。 當(dāng)進(jìn)行這樣的PCR時(shí)，設(shè)計(jì)能夠特異性地?cái)U(kuò)增對象菌的引物為重要。于是，在專利文獻(xiàn)I中，公開了能夠檢測出如下五種食物中毒菌的引物對腸管出血性大腸桿菌0157、沙門氏菌、彎曲菌、李斯特菌和金黃色葡萄球菌群。此外，在專利文獻(xiàn)2中，公開了用于如下目的的引物對使用LAMP法(環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，Loop-Mediated Isothermal Amplification)來擴(kuò)增沙門氏菌 04 群的 DNA。專利文獻(xiàn)I :日本特開2007-274934號公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :日本特開2008-72951號公報(bào)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
專利技術(shù)要解決的課題然而，用這些方法不能檢測出其他的食物中毒菌。在細(xì)菌性食物中毒中，還多有由蠟樣芽孢桿菌或副溶血弧菌引起的情況，包括大腸桿菌、李斯特菌、沙門氏菌、彎曲菌、金黃色葡萄球菌的五種與蠟樣芽孢桿菌和副溶血弧菌的七種食物中毒菌占引起細(xì)菌性食物中毒疾病的原因的90%以上。因此，如果能夠同時(shí)且分別特異性地檢測出這些七種食物中毒菌是否存在于食品或環(huán)境等中，則非常有用。此處，當(dāng)存在多種食物中毒菌時(shí),為了分別特異性地檢測出這些食物中毒菌,需要設(shè)計(jì)能夠同時(shí)擴(kuò)增該多種食物中毒菌的DNA的一部分的引物對。此時(shí)，不得因不同的對象區(qū)域的引物對的引物的組合而擴(kuò)增非對象區(qū)域。此外，當(dāng)存在多個不同的對象區(qū)域引物對時(shí)，如果引物的長度或熔解溫度等相似，則有時(shí)進(jìn)行競爭，因此，需求設(shè)計(jì)能夠進(jìn)行與單一情況相比特異性更高的擴(kuò)增的引物。如此，分別特異性地檢測出多種食物中毒菌是非常困難的，至今認(rèn)為，特異性地檢測出食物中毒菌五種為限，無法檢測出五種以上的多種食物中毒菌。于是，本專利技術(shù)人進(jìn)行了深入研究，反復(fù)進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果成功地開發(fā)出，能夠以上述七個菌種中的八個區(qū)域的毒素區(qū)域基因或生物體內(nèi)必須基因?yàn)閷ο蟆⒎謩e特異性地?cái)U(kuò)增這些基因的多重PCR用引物對，從而完成了本專利技術(shù)。S卩，本專利技術(shù)的目的在于提供能夠特異性地?cái)U(kuò)增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus),彎曲菌(Campylobacter 屬)、大腸桿菌(Escherichia coli)、李斯特菌(Listeria 屬)、沙門氏菌(Salmonella屬)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)中的兩種以上的食物中毒菌的PCR用引物對、PCR用反應(yīng)液、食物中毒菌的檢測方法、以及引物的設(shè)計(jì)方法。用于解決課題的手段本專利技術(shù)的PCR用引物對PCR用引物對是用于通過PCR法來擴(kuò)增核酸的引物對，其由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對混合而成，所述引物對包括第一引物對，具備用于擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號I所示的堿基序列組成的引物和由序列編號2所示的堿基序列組成的引物；第二引物對，具備用于擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號3所示的堿基序列組成的引物和由序列編號4所示的堿基序列組成的引物；第三引物對,具備用于擴(kuò)增彎曲菌(Campylobacter屬)的DNA的、由序列編號5所不的喊基序列組成的引物和由序列編號6所不的喊基序列組成的引物；第四引物對，具備用于擴(kuò)增大腸桿菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列編號7所示的堿基序列組成的引物和由序列編號8所示的堿基序列組成的引物；第五引物對，具備用于擴(kuò)增李斯特菌(Listeria屬)的DNA的、由序列編號9所示的堿基序列組成的引物和由序列編號10所示的堿基序列組成的引物；第六引物對，具備用于擴(kuò)增沙門氏菌(Salmonella屬)的DNA的、由序列編號11所不的喊基序列組成的引物和由序列編號12所不的喊基序列組成的引物；第七引物對，具備用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、由序列編號13所不的喊基序列組成的引物和由序列編號14所不的喊基序列組成的引物；以及第八引物對，具備用于擴(kuò)增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、由序列編號15所不的喊基序列組成的引物和由序列編號16所不的喊基序列組成的引物。另外，本專利技術(shù)的PCR用引物對是用于通過PCR法來擴(kuò)增核酸的引物對，其由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對混合而成，所述引物對包括以蠟樣芽孢桿菌 (Bacillus cereus)的基因組DNA中所包含的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe)為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對、以蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的基因組DNA中所包含的嘔吐毒素合成酶基因(cesB)為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對、以彎曲菌(Campylobacter屬)的基因組DNA中所包含的核糖體基因(16S rDNA)為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對、以大腸桿菌(Escherichia coli)的基因組DNA中所包含的尿苷單磷酸激酶基因(pyrH)為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對、以李斯特菌(Listeria屬)的基因組DNA中所包含的熱休克蛋白基因(dnaj)為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對、以沙門氏菌(Salmonella屬)的基因組DNA中所包含的侵襲性因子相關(guān)基因(invA)為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對、以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的基因組DNA中所包含的熱休克蛋白基因(dnaj)為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對、以及以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的基因組DNA中所包含的耐熱性溶血毒素基因(tdh)為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對。此外，本專利技術(shù)的PCR用反應(yīng)液含有上述PCR用引物對。此外，本專利技術(shù)的食物中毒菌的檢測方法是使用由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對，在利用PCR法的擴(kuò)增對象的試樣中包含對應(yīng)于這些引物對的一個或兩個以上的食物中毒菌的核酸時(shí)，特異性地?cái)U(kuò)增該核酸，并基于所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測食物中毒菌的方法，所述引物對包括第一引物對，具備用于擴(kuò)增臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號I所不的喊基序列組成的引物和由序列編號2所不的喊基序列組成的引物；第二引物對，具備用于擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號3所示的堿基序列組成的引物和由序列編號4所示的堿基序列組成的引物；第三引物對，具備用于擴(kuò)增彎曲菌(Campylobacter屬)的DNA的、由序列編號5所示的堿基序列組成的引物和由序列編號6所示的堿基序列組成的引物；第四引物對，具備用于擴(kuò)增大腸桿菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列編號7所示的堿基序列組成的引物和由序列編號8所示的堿基序列組成的引物；第五引物對，具備用于擴(kuò)增李斯特菌(Listeria屬)的DNA的、由序列編號9所不的喊基序列組成的本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2010.04.14 JP 2010-0933161.ー種PCR用引物對，其用于通過PCR法來擴(kuò)增核酸，其特征在于，由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對混合而成，所述引物對包括 第一引物對具備用于擴(kuò)增臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號I所不的喊基序列組成的引物和由序列編號2所不的喊基序列組成的引物； 第二引物對具備用于擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號3所不的喊基序列組成的引物和由序列編號4所不的喊基序列組成的引物； 第三引物對具備用于擴(kuò)增彎曲菌(Campylobacter屬)的DNA的、由序列編號5所示的喊基序列組成的引物和由序列編號6所不的喊基序列組成的引物； 第四引物對具備用于擴(kuò)增大腸桿菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列編號7所不的喊基序列組成的引物和由序列編號8所不的喊基序列組成的引物； 第五引物對具備用于擴(kuò)增李斯特菌(Listeria屬)的DNA的、由序列編號9所示的堿基序列組成的引物和由序列編號10所不的喊基序列組成的引物； 第六引物對具備用于擴(kuò)增沙門氏菌(Salmonella屬)的DNA的、由序列編號11所不的喊基序列組成的引物和由序列編號12所不的喊基序列組成的引物； 第七引物對具備用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、由序列編號13所不的喊基序列組成的引物和由序列編號14所不的喊基序列組成的引物；以及第八引物對具備用于擴(kuò)增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、由序列編號15所不的喊基序列組成的引物和由序列編號16所不的喊基序列組成的引物。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PCR用引物對，其特征在干， 所述引物對是將所述第一至第八的所有的引物對混合而成的。3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的PCR用引物對，其特征在干， 所述第一至第八引物對中的引物為以下的(A)或(B) (A)在序列編號I 16所示的堿基序列中I個或幾個堿基被缺失、置換或增加而成的引物、 (B)由能夠在嚴(yán)格條件下與如下核酸片段雜交的核酸片段組成的引物，所述核酸片段由與序列編號I 16所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成。4.ー種PCR用引物對，其特征在于， 由具有與權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的PCR用引物對互補(bǔ)的堿基序列的引物組成。5.ー種PCR用引物對，其用于通過PCR法來擴(kuò)增核酸，其特征在于，由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對混合而成，所述引物對包括 以蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的基因組DNA中所包含的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因nhe為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對、 以蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的基因組DNA中所包含的嘔吐毒素合成酶基因cesB為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對、 以彎曲菌(Campylobacter屬)的基因組DNA中所包含的核糖體基因16S rDNA為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對、 以大腸桿菌(Escherichia coli)的基因組DNA中所包含的尿苷單磷酸激酶基因pyrH為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對、 以李斯特菌(Listeria屬)的基因組DNA中所包含的熱休克蛋白基因dnaj為擴(kuò)增對象區(qū)域的引物對、 以沙門氏菌(Salmonella屬)的基因組DNA中所包含的侵襲性因...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：山崎隆明，原田天章，猿渡由寬，龜井修一，
申請(專利權(quán))人：東洋制罐株式會社，東洋鋼鈑株式會社，
類型：
國別省市：