本發明專利技術的目的是制作出新的修飾型蛋白質A配體，其具有比現有的修飾型蛋白質A配體更好的抗體酸解離特性。本發明專利技術提供了對免疫球蛋白具有親和性的蛋白質，其中該蛋白質是具有如下氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列相對于來源于蛋白質A的E、D、A、B和C結構域的任何結構域的氨基酸序列，將至少1個氨基酸取代突變導入至在與所有結構域中都保守的、A、B和C結構域的第31~37位(E結構域的第29~35位，D結構域的第34~40位)相對應的氨基酸殘基上而得到的氨基酸序列，并且，與具有導入該突變前的氨基酸序列的蛋白質相比，本發明專利技術的蛋白質與免疫球蛋白的Fab區域的親和性降低。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及與抗體特異性結合的蛋白質，以及以該蛋白質作為免疫球蛋白結合性親和配體的親和分離基質，以及使用所述基質對抗體進行分離純化或吸附去除的方法。
技術介紹
抗體具有與被稱為抗原的物質進行特異性結合的功能，以及協同其他的生物分子或細胞，將具有抗原的因子脫毒、去除的功能。所謂“抗體”這個名稱，是強調這種與抗原結合的功能的名稱，這類物質也被稱為“免疫球蛋白(Ig) ”。近年來，伴隨著基因工程、蛋白質工程和細胞工程的發展，被稱為抗體藥物的利用抗體所具有的功能的藥物開發盛行。由于與傳統藥物相比，抗體藥物更加特異性地作用于靶分子，因此預期其可以使副作用減輕并且獲得高療效，實際上有助于改善各種疾病。另一方面，因為抗體藥物是向生物體內大量施用的，因此與其他的重組蛋白質藥品相比的情況下，抗體藥物的純度對品質產生更大的影響。由此，為了制造高純度的抗體，親和層析等方法被普遍使用，親和層析利用特異性結合抗體的分子作為配體的吸附材料。作為抗體藥物得到開發的基本上是單克隆抗體，使用重組的細胞培養技術等進行大量生產。“單克隆抗體”是指從來源于單一抗體生產細胞的克隆所獲得的抗體。現在上市的抗體藥物，基本上在分子結構上都是免疫球蛋白G(IgG)亞類。作為與IgG抗體具有親和性的免疫球蛋白結合蛋白質，普遍已知的是蛋白質A。蛋白質A是由革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生產的細胞壁蛋白質的I種，由信號序列S、5個免疫球蛋白結合結構域(E結構域、D結構域、A結構域、B結構域、C結構域)以及細胞壁結合結構域即XM結構域構成(非專利文獻I)。在抗體藥物制造步驟的早期純化步驟(捕獲步驟)中，將蛋白質A作為配體固定在水不溶性擔載體上的親和層析用柱(下文稱為蛋白質A柱)被普遍使用(非專利文獻I、非專利文獻2、非專利文獻3)。為了改善蛋白質A柱的性能，進行了種種技術開發。從配體方面出發的技術研發也在進行中。最初使用野生型蛋白質A作為配體，但以加入蛋白質工程修飾的重組蛋白質A作為配體而對于柱子性能進行改善的技術也日益增多。作為典型的重組蛋白質A，可列舉沒有免疫球蛋白結合活性的、去除了 XM區域的重組蛋白質A(rProtein A Sepharose (注冊商標)，GE healthcare Japan公司生產)。以去除了 XM區域的重組蛋白質A作為配體的柱子，具有抑制傳統制品中的蛋白質的非特異性吸附的優點，現在在產業上普遍使用。此外，還有以向蛋白質A中導入I個Cys突變的重組蛋白質A (專利文獻1)，或者導入多個Lys突變的重組蛋白質A(專利文獻2)作為配體使用的專利技術。這些技術表現出固定在水不溶性擔載體上的效果，具有降低抗體與柱子的結合容量和減少固定化配體泄露的優點。作為進行了修飾的重組蛋白質A，普遍已知利用在B結構域中導入突變的修飾結構域(被稱為Z結構域)作為配體的技術(非專利文獻I、非專利文獻4、專利文獻3)。Z結構域相對于B結構域，是導入了將第29位的Gly取代為Ala的突變的修飾結構域。并且，在Z結構域中，可以同時導入Val取代B結構域的第I位的Ala的取代突變，這是以方便基因工程制造復數個結構域連接而成的編碼基因為目的的突變，對結構域的功能幾乎沒有影響(例如，在專利文獻4中，實施例使用了 Ala取代了 Z結構域的第I位的Val的變體)。已知Z結構域比B結構域的耐堿性更高，具有使用殺菌、洗滌效果好的堿溶液洗滌后可對柱子重復利用的優點。以Z結構域為基礎，專利技術了用其他氨基酸取代Asn，產生更高的耐堿性的配體(專利文獻5、專利文獻6)，也開始用于產業。由此可見，對于蛋白質A的免疫球蛋白結合結構域(E、D、A、B和C結構域)，導入將第29位的Gly取代為Ala的突變的有效性是普遍已知的。實際上，自1987年公開該“G29A”的突變以來，在后研發的涉及修飾蛋白質A的現有技術中，也導入了該“G29A”的突變(專利文獻2、專利文獻4、專利文獻6)。 作為Z結構域的另一個特征，可列舉與免疫球蛋白的Fab區域結合力變弱(非專利文獻5)。由于該特征，在用酸來解離結合的抗體的步驟中，具有易于解離抗體的優點(非專利文獻I、專利文獻7)。抗體易于解離，是可以用更少體積的洗脫液回收含有更高濃度抗體的洗脫液。近年來，在抗體藥物制造中，每一批次的細胞培養液量超過10，000升，近幾年抗體表達水平提高到了 10g/L(非專利文獻6)。下游的純化步驟必須達到與該處理規模擴大對應，對以少量洗脫液回收含有更高濃度抗體的洗脫液的技術改進具有極大期望。除Z結構域以外，作為修飾蛋白質A ·配體，以蛋白質A的C結構域為基礎的研究不斷深入(專利文獻4)。這類配體的特征是產生了野生型C結構域本來具有的高耐堿性，代替基于B結構域制造而成的Z結構域，作為新的基礎結構域受到關注。但是，對于C結構域的檢驗結果證實，在使用酸將與C結構域結合的抗體進行解離的步驟中，存在抗體難以解離的缺點。在非專利文獻2和專利文獻4中，C結構域表現出與免疫球蛋白的Fab區域的強結合力，推測該特征是難以用酸解離抗體的原因。為了改善這一缺點，使用導入了第29位的Gly被Ala取代的突變的C結構域，在檢驗抗體酸解離特性時，相比野生型C結構域，可見抗體有變得易于解離的傾向，但仍不充分。由此可見，現在公知的使抗體變得易于從蛋白質A的免疫球蛋白結合結構域上解離的突變只有“G29A”。如前所述，“G29A”除了易于解離抗體這一點以外還有優點，預期通過第29位以外的突變技術來改善。但是，尚未報道除第29位以外的突變，能夠使抗體更易于解離。現有技術文獻專利文獻專利文獻I :美國專利第6399750號公報專利文獻2 :日本特開2007-252368號公報專利文獻3 :美國專利第5143844號公報專利文獻4 日本特開2006-304633號公報專利文獻5 :歐州專利第1123389號公報專利文獻6 :國際公開第03/080655號公報專利文獻7 :美國公開第2006/0194950號公報非專利文獻非專利文獻I Hober S.等人，“J. Chromatogr. B” 2007 年，第 848 卷，第 40 47 頁非專利文獻2 Low D.等人，“L. Chromatogr. B” 2007 年，第 848 卷，第 48 63 頁非專利文獻3:Roque A. C. A.等人“ J. Chromatogr. A”2007 年，第 1160 卷，第 44 55頁非專利文獻4 :Nilsson B.等人“Protein Engineering” 1987 年，第 I 卷，第107 113頁非專利文獻5 :Jansson B.等人“FEMS Immunology and MedicalMedicalMicrobiology ^ 1998 年，第 20 卷，第 69 78 頁 非專利文獻6 :稻川淳一等人“分離技術(分離技術)”2008年，第38卷，第20廣207頁
技術實現思路
專利技術要解決的問題本專利技術要解決的問題是通過向第29位以外的氨基酸導入突變，產生了具有比現有的修飾型蛋白質A配體具有更好的抗體酸解離特性的新型修飾蛋白質A配體。解決問題的方法本專利技術人對在第29位以外的位置具有氨基酸取代突變的大量本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.03.24 JP 2010-0688701.一種對免疫球蛋白具有親和性的蛋白質，其中， 所述蛋白質具有下述氨基酸序列在來源于 選自蛋白質A的E、D、A、B和C結構域中的至少一個結構域的氨基酸序列中，將至少I個氨基酸取代突變導入至A、B和C結構域的第37位的氨基酸殘基、E結構域的第29 35位的氨基酸殘基、或D結構域的第34 40位的氨基酸殘基中而得到的氨基酸序列，所述蛋白質A的E、D、A、B和C結構域由序列號f 5所記載， 與導入突變前的蛋白質相比，所述蛋白質與免疫球蛋白的Fab區域的親和性降低。2.權利要求I所記載的蛋白質，其中，導入突變前的來源于結構域的氨基酸序列是 序列號I飛所記載的蛋白質A的E、D、A、B和C結構域的氨基酸序列，或 序列號6 10所記載的來源于蛋白質A的E、D、A、B和C結構域的氨基酸序列。3.權利要求I或2所記載的蛋白質，其中，導入突變前的來源于結構域的氨基酸序列是 序列號5所記載的蛋白質A的C結構域的氨基酸序列，或 序列號10所記載的來源于蛋白質A的C結構域的氨基酸序列。4.權利要求廣3中任一項所記載的蛋白質，其中，在導入突變前的氨基酸殘基中， 各結構域中的對應于C結構域的第33位的氨基酸殘基是Ser， 各結構域中的對應于C結構域的第35位的氨基酸殘基是Lys， 各結構域中的對應于C結構域的第36位的氨基酸殘基是Asp，或 各結構域中的對應于C結構域的第37位的氨基酸殘基是Asp。5.權利要求廣4中任一項所記載的蛋白質，其中，所導入的氨基酸取代突變是 將對應于C結構域的第33位的Ser取代為Glu、Leu或Thr的突變， 將對應于C結構域的第35位的Lys取代為Arg的突變， 將對應于C結構域的第36位的Asp取代為Arg或Ile的突變，或 將對應于C結構域的第37位的Asp取代為Glu的突變。6.權利要求5所記載的蛋白質，其中，所導入的氨基酸取代突變是將對應于C結構域的第33位的Ser取代為Glu的突變。7.一種蛋白質，其是將2個以上的權利要求I飛中任一項所記載的蛋白質相互連接而得到...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吉田慎一，村田大，平良俊一，高野昌行，井口惠太，中野喜之，
申請(專利權)人：株式會社鐘化，
類型：
國別省市：
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