腐蝕穩定性色譜分析用配體制造技術

本發明專利技術涉及具有提高的腐蝕穩定性的色譜分析用配體，如，基于免疫球蛋白結合蛋白的配體，如，葡萄球菌A蛋白，以及制備和使用所述配體的方法。

【技術實現步驟摘要】
【專利說明】腐蝕穩定性色譜分析用配體 本申請是申請日為2009年12月23日的第200911000241. 1號專利技術名稱為"腐蝕穩定 性色譜分析用配體"的中國專利申請的分案申請。 相關申請 本申請要求申請號為No. 61/203, 664,申請日為2008年12月24日的美國臨時專利申 請的優先權，其全部內容在此全部并入本申請。
本專利技術涉及具有提高的腐蝕穩定性的色譜分析用配體，例如，基于免疫球蛋白結合蛋 白（如，葡萄球菌A蛋白）的配體，以及包含此類配體的色譜分析基質。
技術介紹
在親和色譜分析中使用的配體通常賦予對靶分子的高選擇性，因此導致了對靶分子的 高收率以及快速而經濟的純化。基于葡萄球菌A蛋白（SpA)的試劑以及色譜分析基質達到 了在捕獲和純化抗體的親和色譜分析中的廣泛應用，并且由于其結合IgG而對免疫球蛋白 和抗體的親和性沒有顯著影響的能力，其同樣廣泛應用于抗體檢測方法。 據此，已經開發了多種包含A蛋白一配體的試劑以及介質，并且在商業上可獲 得，包括，例如，P丨，〇Sep⑧一vAHighCapacity，PrQ:Se_)vAUltra和：PrOSep? UltraPlus(Millipore)及ProteinASepharose?，MabSelect?，MabSelectXtra?和 MabSelectSuRe.⑧（GEHealthcare)和PorosMabCaptureA?(AppliedBiosystems)。 為了維持色譜分析用配體（所述配體包括，如，包含基于SpA的色譜分析用配體的樹 脂）的選擇性和結合能力，需要對配體結合樹脂（稱作色譜分析基質）進行清潔，并且通常 在堿性條件下清洗，如，使用氫氧化鈉。舉例來說，用于清洗和復原基質的標準過程是一種 原位清洗（Cleaning-in-place，CIP)的堿性方案，一般包括使用pH14的1MNaOH對基質進 行處理。但是，這種不太溫和的處理經常是不期望的，當配體是一種蛋白或是基于蛋白的分 子時尤其如此。
技術實現思路
本專利技術提供了具有堿穩定性的基于SpA的色譜分析用配體，例如，其能夠耐受重復的 原位清洗（CIP)循環。更特別的是，基于本專利技術的配體可以在延長的時間中耐受傳統的堿 性清洗，這使得所述配體成為引人注目的候選物，特別是對于免疫球蛋白進行低成本高效 率且高水平的純化而言尤為如此。 在本專利技術的一個方面，堿穩定性色譜分析用配體包含兩個或更多個SpA結構域。例如， 在這方面的一些實施方式中，提供了堿穩定性色譜分析用配體，所述配體包含兩個或更多 個葡萄球菌A蛋白（SpA)或其功能性片段或變體的B結構域或者兩個或更多個SpA或其功 能性片段或變體的Z結構域，所述兩個或更多個B結構域或者兩個或更多個Z結構域被附 著在色譜分析樹脂上，附著位點為樹脂上的多于一個位點。 在基于該方面的一些實施方式中，所述配體包含三個或更多個SpA或其功能性片段或 變體的B結構域或者三個或更多個SpA或其功能性片段或變體的Z結構域，所述三個或更 多個B結構域或者三個或更多個Z結構域被附著在色譜分析樹脂上，附著位點為樹脂上的 多于一個位點。在另一些實施方式中，所述配體包含四個或更多個SpAB結構域或者四個 或更多個SpAZ結構域，所述四個或更多個B結構域或四個或更多個Z結構域被附著在色 譜分析樹脂上，附著位點為樹脂上的多于一個位點。在其它實施方式中，所述配體包含五個 或更多個SpAB結構域或五個或更多個SpAZ結構域；或包含六個或更多個SpAB結構域 或六個或更多個SpAZ結構域；或包含七個或更多個SpAB結構域或七個或更多個SpAZ 結構域，所述五個或更多個B結構域或五個或更多個Z結構域，六個或更多個B結構域或六 個或更多個Z結構域，七個或更多個B結構域或七個或更多個Z結構域，被附著在色譜分析 樹脂上，附著位點為樹脂上的多于一個位點。 基于本專利技術的另一方面，堿穩定性色譜分析用配體包含一個或多個分離的葡萄球菌A蛋白E、D、A、B、C或Z結構域，所述一個或多個分離的結構域包含位于n+1位的一個或多個 突變為除半胱氨酸（C)、絲氨酸（S)、丙氨酸（A)、甘氨酸（G)、天冬酰胺（N)、或谷氨酰胺（Q) 之外的任何天然存在的氨基酸的氨基酸殘基。在一些實施方式中，n代表分離的SpA結構域 的23位天冬酰胺殘基。在分離的SpA結構域的24位具有突變的示例性配體如表1所示， 其中n代表天冬酰胺。 表1天然氨基酸的單字母代碼及其對應的編碼每個氨基酸的三字母密碼子在表2中列出。 一般地，由于密碼子的簡并性，多于一個三字母密碼子可以編碼同一個氨基酸。 表2本專利技術還包括一種包含基于本專利技術的一個或多個方面的配體的色譜分析基質，該基質 偶聯在固體支持物上，如，至少一種不溶的載體。 另外，此處提供了使用這種配體的方法。因此，提供了從樣品中分離一種或多種靶分子 (如，免疫球蛋白）的親和純化方法，所述方法包括如下步驟：(a)提供包含一種或多種靶分 子（如，免疫球蛋白）的樣品；(b)在一種或多種靶分子（如，免疫球蛋白）同基質結合的 條件下將樣品與基于本專利技術的基質接觸；和（c)在適宜的條件下，例如，合適的pH，通過洗 脫而回收一種或多種結合的靶分子（如，免疫球蛋白）。 在一些實施方式中，在0. 5MNaOH中溫育5小時后，或10小時后，或15小時后，或25 小時后，或30小時后，本專利技術的堿穩定性色譜分析用配體至少保留其95%的結合能力。 此處所述的能被多種配體結合的免疫球蛋白包括，如，IgG，IgA和IgM，或包含抗體或 抗體任意片段的任何融合蛋白。 此處同樣提供了編碼多種所述配體的核酸分子，以及包含這些核酸分子的宿主細胞。 在一些實施方式中，宿主細胞為原核細胞。在其它實施方式中，宿主細胞為真核細胞。 另外，本專利技術同樣包括了包含此處所述的一種或多種配體及其功能性片段和變體的多 肽庫。在另一個實施方式中，本專利技術提供了核酸分子庫，所述核酸分子編碼本專利技術的一種或 多種配體或編碼其功能性片段和變體。 在一些實施方式中，本專利技術提供了基于SpA的配體，其與已知的SpA配體相比展示了變 化的（上升或者下降的）結合免疫球蛋白的Fab片段的能力，但維持了同免疫球蛋白的Fc 片段結合的能力。在一個實施方式中，基于本專利技術的一種基于SpA的配體顯示了與野生型 的SpA相比下降的結合免疫球蛋白的Fab片段的能力。在一個示例的實施方式中，基于本 專利技術的堿穩定性色譜分析用配體進一步包括第29位的甘氨酸被丙氨酸取代。在另一個實 施方式中，基于本專利技術的堿穩定性色譜分析用配體還包括第29位的甘氨酸被除丙氨酸或 色氨酸外的氨基酸取代。 附圖簡沭 圖1描述了SpA的野生型（wt)的IgG結合結構域的核酸序列，如SEQIDNO:1 - 5所 示。SEQIDN0:1表示wtE結構域的核酸序列；SEQIDN0:2表示wtD結構域的核酸序 列；SEQIDN0:3表示wtA結構域的核酸序列；SEQIDN0:4表示wtB結構域的核酸序列； SEQIDN0:5表示wtC結構域的核酸序列。 圖2描述了SpAZ結構域的核酸序列，如SEQIDNO:6所示。 圖3描述了SpA的野生型（wt)的IgG結合結構域（E、D、A、B和C)的氨基本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種堿穩定性色譜分析用配體，所述配體包含兩個或更多個葡萄球菌A蛋白(SpA)或其功能性片段或變體的B結構域或者兩個或更多個SpA或其功能性片段或變體的Z結構域。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：N·卞，N·索伊斯，S·斯佩克特，K·萊文，
申請(專利權)人：EMD密理博公司，
類型：發明
國別省市：美國;US