一種增強多糖蛋白結合物免疫原性的方法技術

本發明專利技術公開了一種增強多糖蛋白結合物免疫原性的方法，通過在蛋白載體中加入萬能表位肽，并采用基因重組工程菌來生產含有萬能表位肽的蛋白載體；然后將多糖通過共價鍵連接至所述含有萬能表位肽的蛋白載體上形成多糖蛋白結合物；采用這種方法獲得的多糖蛋白結合物與不含有萬能表位肽的對應蛋白載體獲得的多糖蛋白結合物相比較，其免疫原性比對照提高了3-5倍。

【技術實現步驟摘要】

: 本專利技術涉及一種能夠增強多糖蛋白結合物免疫原性的方法。
技術介紹
: 當多糖以共價鍵連接至蛋白載體上時，能將半抗原的多糖轉變成全抗原，使得多糖的免疫原性得到增強。以此方法合成的多糖-蛋白結合疫苗已被廣泛地應用于小兒，成功地預防了包括肺炎球菌，流行性腦膜炎球菌以及流行性嗜血桿菌b型等細菌的感染。 用于合成多糖蛋白結合物的蛋白載體有多種，如破傷風類毒素、白喉類毒素、白喉毒素變異體CRM197，以及基因重組技術生產的流行性嗜血桿菌表面蛋白D等；但是，由于不同蛋白的免疫特性，以不同蛋白載體合成的多糖蛋白結合物的免疫原性有差異，動物體免疫后，對于由不同蛋白載體與同一種多糖合成形成的多糖蛋白結合物，所顯現的多糖免疫原性也不同。由此可見，采用不同技術生產的蛋白載體，合成出來的多糖蛋白結合疫苗的免疫原性有差異。 進入動物機體內后，抗原經抗原處理細胞(Antigen Process Cell, APC)處理后產生表位肽(epitope) [I],在和主要組織相容性復合物(Major HistocompatibilityComplex,MHC)分子結合后，進而呈現在APC細胞表面，能夠被T淋巴細胞識別，這是免疫學通過實驗已經得出的結論。現在知道，一個已知表位肽的免疫原性取決于三個因素: 第一、適當表位肽的產生； 第二、和表位肽結合的主要組織相容性復合物分子的呈現； 第三、識別表位肽與主要組織相容性復合物形成的結合物的T細胞的呈現。 其中，任何一個環節的缺少都將導致免疫應答缺失。 用小鼠進行的試驗表明，缺乏適當的表位肽與主要組織相容性復合物形成的結合物分子是最常導致動物體免疫響應缺失的原因。主要組織相容性復合物具有高度的多形態性，已知的表位肽僅通過一個或者幾個等位基因(Alleles)就可結合至主要組織相容性復合物，而不是全部表位肽片段。另外，有實驗結果顯示，由于抗原處理不適當，或者T細胞耐受性空缺,也會導致免疫響應的缺失。 有實驗表明，破傷風毒素的三個表位肽中的兩個，即QYIKANSKFIGITEL表位肽(稱為 P2)和 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE 表位肽(稱為 P30)，以及 ISQAVHAAHAEINEAGR表位肽(稱為OVAp) [2]，可和大量不同的主要組織相容性復合物Class II結合，顯示其能夠被T細胞識別，具有萬能免疫原性的特性，被稱之萬能表位肽。 萬能免疫原性表位肽具有和多個人類主要組織相容性抗原復合物Class II分子的同型和異型體結合。這種萬能表位肽和人類主要組織相容性抗原復合物Class II分子隨機的結合可用于開發合成疫苗，因為其能夠激活人群中的大部分個體的獲得性免疫系統的應答。 研究表明，P2表位肽由破傷風毒素的830 - 844氨基酸序列組成(QYIKANSKFIGITEL)，P30表位肽由破傷風毒素的947 - 967氨基酸序列組成(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)，OVAp表位肽是由卵清蛋白的323 - 339氨基酸序列組成(ISQAVHAAHAEINEAGR)。在含有這些表位肽的蛋白進入機體后，蛋白將被攝入至APC細胞內，被消化降解，但是這些表位肽將保存完整，在和主要組織相容性復合物結合后，被呈現在APC細胞表面，并被T細胞識別，這表明萬能表位肽以相同的方式和多種DR分子作用。 MHC分子是加工后抗原的雜性受體，其功能是在胸腺中的免疫耐受誘導和周邊免疫響應外來抗原的過程中，來呈現其抗原中的表位肽。因此，MHC分子必須在呈現大量的表位肽(容許更好的抗原識別，但更多的消耗T細胞儲備)，和少許表位肽(大量的T細胞儲備，但是少許有效地呈現外來抗原)中達到平衡。也就是說，如果抗原中含有在APC細胞處理后能夠保存完整性、并具有代表性的少量表位肽，在和MHC結合后，就能夠刺激一定量的T細胞，來建立免疫記憶效應，而這一過程不會消耗過量的T細胞造成免疫耐受，含有這種表位肽的抗原具有更強的免疫原性，這也就解釋了為什么破傷風類毒素具有很強的免疫原性的原因。 現發現的大部分T細胞的刺激表位肽對于不同MHC Class II單體(haplotype)作用有限，不同動物保存和呈現不同的抗原多肽區域Gpitopes)來刺激其T細胞。這種T細胞刺激活性的基因限制嚴重地阻礙了以合成方法來開發疫苗，而這種方法對于基因上不同的人群的應用，應該是非常有效的方法。那些被發現具有刺激多重小鼠個體和/或與大多數人體MHC Class II分子相關聯的T細胞刺激表位肽，提供了一個設計萬能活化T細胞的有效途徑。在普通的蛋白抗原中加入萬能表位肽(也稱為萬能T細胞抗原簇)，如P2、P30或OVAp等，能夠被大多數動物的MHC Class II分子識別。這種T細胞抗原簇能夠用于直接誘導T細胞，或提供幫助B細胞生產針對于弱免疫原的抗體，增強獲得性免疫應答的效應。 致病性細菌通常能夠表達高分子量、包裹在細菌表面的莢膜多糖，簡稱多糖。對于成人來說，莢膜多糖是具有很好的免疫原性抗原，可用于制備疫苗；但是，對于小兒，即2歲以下的嬰幼兒，莢膜多糖被認為是非依賴于T細胞抗原。實驗顯示，當用作抗原時，莢膜多糖可誘導野株或者T細胞缺失小鼠生產多糖特異性IgM抗體的響應；但是，并不誘導IgM抗體向IgG抗體的轉化。人體實驗也顯示，作為疫苗，多糖可以誘導成人生產保護性抗體，但無法誘導嬰幼兒的免疫應答；也就是說，在小兒重復免疫莢膜多糖抗原后，無第二次抗體增強響應，也無法誘導持續的T細胞記憶。 現代免疫學實驗證實，多糖蛋白結合疫苗和純多糖疫苗比較的優勢在于，前者能夠誘導免疫響應。當非依賴T細胞的莢膜多糖共價鍵地連接至載體蛋白而產生的多糖蛋白結合物，在免疫了哺乳動物后，可誘導T細胞來幫助B細胞產生針對于結合物中的多糖部分的IgG抗體。因此，多糖蛋白結合物誘導多糖特異性抗體IgM轉化為IgG，記憶B細胞的分化，以及長期存在的T細胞記憶。 多糖結合疫苗在預防嚴重的傳染病中，比如，流行性嗜血桿菌b型，肺炎球菌，以及流行性腦膜炎球菌，發揮了巨大的作用。不過，這些多糖蛋白結合疫苗的免疫原性變異性較大，這種變異性除了是由于特定多糖結構的差異性的結果外，不同免疫原性蛋白載體的使用，也是導致多糖蛋白結合物的免疫原差異主要原因。在某些高危人群中，比如小兒、老年人或免疫功能低下人，低免疫原性的多糖蛋白質結合疫苗的免疫效果不佳，保護性受到限制。因此，開發出免疫原性更強的多糖蛋白結合疫苗，仍然是該領域努力的方向。 本專利技術用基因重組技術生產的含有萬能表位肽蛋白載體，在多糖蛋白質結合物中引入萬能表位肽。在這種結合物進入動物體后，經過抗原呈遞細胞(APC)吞噬消化降解后，其萬能表位肽和部分多糖重復單位，和主要組織相容性復合物Class II結合，可有效地刺激T細胞，進而增強結合物中多糖的免疫原性，導致針對細菌莢膜多糖的抗體濃度增加。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供，通過在蛋白載體中加入萬能表位肽，采用基因重組工程菌來生產含有萬能表位肽的蛋白載體；然后將多糖通過共價鍵連接至所述含有萬能表位肽的蛋白載體上形成多糖蛋白結合物；這種多糖蛋白結合物與不含有萬能表位肽的對應蛋白載體形成的多本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種增強多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其特征在于：a)在蛋白載體中加入萬能表位肽，通過基因重組工程菌來生產含有萬能表位肽的蛋白載體；b)多糖通過共價鍵連接至所述含有萬能表位肽的蛋白載體上形成多糖蛋白結合物。

【技術特征摘要】
1.一種增強多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其特征在于: a)在蛋白載體中加入萬能表位肽，通過基因重組工程菌來生產含有萬能表位肽的蛋白載體； b)多糖通過共價鍵連接至所述含有萬能表位肽的蛋白載體上形成多糖蛋白結合物。2.根據權利要求1所述的增強多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其特征在于:在所述含有萬能表位肽的蛋白載體中含有X個萬能表位肽，X大于等于I。3.根據權利要求1所述的增強多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其特征在于:在含有萬能表位肽的蛋白載體中，萬能表位肽是連結在蛋白載體的N-末端或C-末端，或者同時連接在N-末端和C-末端。4.根據權利要求1、2或3所述的增強多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其特征在于:所述萬能表位肽與指定蛋白載體的N-末端、或C-末端的之間是通過GSGSG氨基酸序列進行連接。5.根據權利要求1或2可3所述的增強多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其特征在于:所述萬能表位肽為 QYIKA...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李建平，
申請(專利權)人：江蘇康泰生物醫學技術有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32