一種西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體的制備方法及應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)提供的制備方法包括：preM/EⅢ融合蛋白構(gòu)建及純化、動物免疫、細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞株篩選、小鼠腹水制備以及單克隆抗體的純化。可應(yīng)用于制備臨床檢測試劑，用于臨床診斷西尼羅河病毒。本發(fā)明專利技術(shù)西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體的制備，不僅制備時(shí)間短、操作簡單，而且提取的抗體效價(jià)高，可以滿足臨床診斷的需要。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】


本專利技術(shù)涉及一種單克隆抗體的制備和應(yīng)用，尤其涉及一種西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體抗體的制備及應(yīng)用。

技術(shù)介紹

西尼羅病毒病是由西尼羅病毒(WestNileVirus,WNV)引起的傳染病，是一種人獸共患病。近年來西尼羅病毒病出現(xiàn)在歐洲和北美的溫帶區(qū)域，對人和動物的健康構(gòu)成了威脅。這種病嚴(yán)重的危害是使人和馬患上致命的腦炎，使鳥，雞等死亡。西尼羅病毒最初是1937年從烏干達(dá)西尼羅地區(qū)一名發(fā)熱的婦女血液中分離出來而被發(fā)現(xiàn)，因此得名為西尼羅病毒。WNV的主要傳播媒介為庫蚊和其他蚊子，經(jīng)蚊子傳播給人、馬和鳥類等，導(dǎo)致宿主出現(xiàn)西尼羅河熱或西尼羅河病毒性腦膜腦炎。WNV具有較高的致死率，其爆發(fā)范同逐漸增加，現(xiàn)已在非洲、中東、西亞、中亞、澳大利亞、北美以及亞洲流行和蔓延，對人類的健康造成了極大的威脅。
臨床針對WNV治療尚無特效藥物，因此主要以預(yù)防為主。WNV的臨床診斷主要以血清學(xué)檢測為主，但是WNV與日本腦炎病毒(JEV)、圣路易斯腦炎病毒(SLEV)、黃熱病毒(YFV)和登革熱病毒(DENV)等存在著嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，臨床診斷準(zhǔn)確性較低。因此尋求高特異的抗WNV的單克隆抗體成為臨床急需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

本專利技術(shù)的目的在于提供一種高特異性的抗preM/EⅢ單克隆抗體，為臨床診斷WNV奠定了基礎(chǔ)。
本專利技術(shù)提供了一種西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：preM/EⅢ融合蛋白構(gòu)建及純化、動物免疫、細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞株篩選、小鼠腹水制備以及單克隆抗體的純化。
本專利技術(shù)提供了一種西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體的制備方法，preM/EⅢ融合蛋白構(gòu)建及純化包括用HindⅢ、BamHI雙酶切pET28a和preM/EⅢ，T4連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，獲得重組質(zhì)粒。測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，運(yùn)用SDS-PAGE、Westemblot分析鑒定表達(dá)產(chǎn)物，并采用Ni離子親和層析法純化preM/EⅢ，作為免疫抗原。
本專利技術(shù)提供了一種西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體的制備方法，動物免疫采用雌性Balb/c小鼠。
本專利技術(shù)提供了一種西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體的制備方法，細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞株篩選，采用間接ELlSA對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。篩選呈陽性的雜交瘤細(xì)胞按照有限稀釋法得到穩(wěn)定分泌抗preM/EⅢ融合蛋白的單克隆抗體的亞克隆。
本專利技術(shù)提供了一種西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體的制備方法，小鼠腹水制備以及單克隆抗體的純化，離心后上清采用ProteinGSepharose親和層析柱進(jìn)行純化。
本專利技術(shù)提供的一種西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體可用于制備臨床檢測試劑，用于臨床診斷。
實(shí)施方式：下面通過具體實(shí)施例，對本專利技術(shù)的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說明，但是本專利技術(shù)并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1：西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體制備方法
（1）preM/EHI融合蛋白構(gòu)建及純化
根據(jù)Genbank已公布的preM和EⅢ基因序列設(shè)計(jì)引物，分別以WNV基因組為模板擴(kuò)增preM和EⅢ基因，然后采用Overlaping技術(shù)將preM和EⅢ基因連接，中間通過45個堿基(編碼GSGGSGGSGGSGGGSGGSGGG)連接，最終獲得preM和EⅢ基因的全長基因，簡稱preM/EⅢ。用HindⅢ、BamHI雙酶切pET28a和preM/EⅢ，T4連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，獲得重組質(zhì)粒。測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，運(yùn)用SDS-PAGE、Westemblot分析鑒定表達(dá)產(chǎn)物，并采用Ni離子親和層析法純化preM/EⅢ，作為免疫抗原。
（2）動物免疫
以preM/EⅢ融合蛋向免疫10周的雌性BALB/cd小鼠，初次免疫將preM/EⅢ融合蛋白與弗氏完全佐劑按l：1比例充分混合乳化，進(jìn)行多位點(diǎn)注射，每只小鼠免疫劑量為50μg；14d后將相同劑量的preM/EⅢ融合蛋白與弗氏不完全佐劑乳化進(jìn)行第2次免疫。24d后進(jìn)行第3次免疫，劑量及操作同第2次免疫。在第2次和第3次免疫l周后斷尾取血采用間接ELISA檢測抗體水平。在進(jìn)行細(xì)胞融合前3d，對抗體水平表達(dá)較高的BALB/c小鼠腹腔注射無佐劑的preM/EHⅢ融合蛋白50μg，進(jìn)行強(qiáng)化免疫。
（3）細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞株篩選
取免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞以10：l的比例混合，置于37℃水浴中加入PEG4000進(jìn)行融合，用無血清DMEM培養(yǎng)基終止融合后離心棄上清，將細(xì)胞重懸于次黃嘌呤、氨基喋呤于胸腺嘧啶脫氧核苷選擇培養(yǎng)基中，接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，第10d后開始篩選。以preM/EⅢ融合蛋白包被96孔扳，以免疫效果較好的小鼠血清和未免疫的小鼠血清作為陽性對照和陰性對照，采用間接ELlSA對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。篩選呈陽性的雜交瘤細(xì)胞按照有限稀釋法得到具有穩(wěn)定分泌抗preM/EⅡl融合蛋的單克降抗體的亞克隆。
（4）小鼠腹水制備以及單克隆抗體的純化
每只BALB/c小鼠腹腔注射滅菌的石蠟油1mL,1周后再次腹腔注射穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2×106，小鼠腹腔變大后抽取腹水，離心后上清采用ProteinGSepharose親和層析柱進(jìn)行純化。
實(shí)施例2：西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體的特異性分析實(shí)驗(yàn)
（1）間接ELISA
將preM/EⅢ融合蛋白以及WNV、JEV、SLEV、YFV，DENV等病毒裂解液和BSA包被酶標(biāo)板進(jìn)行間接ELISA，分析抗preM/EⅢ融合蛋白單克隆抗體的特異性。
（2）Westernblot
將純化的preM/EⅢ融合蛋白以及差速離心濃縮純化的WNV、JEV、SLEV、YFV，DENV等病毒溶于loadingbuffer，進(jìn)行SDS-PAGE，恒壓將蛋門條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜；將純化的抗體l：5000稀釋作為一抗4℃過夜后，PBS洗滌3次后，加入l：4000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1h，PBS洗滌3次，在發(fā)光液中孵育lmin，用x光片曝光至條帶清晰。
（3）單克隆抗體效價(jià)
以preM/EⅢ融合蛋白(10mg/L)作為抗原，將從腹水中純化的單克隆抗體從10-2起10倍稀釋至10-2作為一抗(連續(xù)梯度稀釋)，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠lgG作為二抗采用間接ELISA對純化的單克隆抗體進(jìn)行效價(jià)分析。以BSA為陰性對照。酶標(biāo)儀檢測A450值，以大于或等于陰性對照A450值2.1倍為陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。
（4）單克隆抗體亞類分析
單免隆抗體亞類分析根據(jù)SBAClonotyping“System／HRP抗體亞類鑒定試劑盒操作步驟進(jìn)行。
（4）臨床樣本檢測的準(zhǔn)確性分析
取臨床確診的WNV(25例)、JEV(34例)感染者的血清，采用間接ELISA對純化的單克隆抗體的臨床診斷準(zhǔn)確性進(jìn)行分析。同時(shí)以本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：preM/EⅢ融合蛋白構(gòu)建及純化、動物免疫、細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞株篩選、小鼠腹水制備以及單克隆抗體的純化。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：preM/EⅢ融合蛋白構(gòu)建及純化、動物免疫、細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞株篩選、小鼠腹水制備以及單克隆抗體的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種西尼羅河病毒preM/EⅢ融合蛋白特異性單克隆抗體的制備方法，其特征在于：preM/EⅢ融合蛋白構(gòu)建及純化包括用HindⅢ、BamHI雙酶切pET28a和preM/EⅢ，T4連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，獲得重組質(zhì)粒。
3.測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，運(yùn)用SDS-PAGE、Westemblot分析鑒定表達(dá)產(chǎn)物，并采用Ni離子親和層析法純化preM/EⅢ，作為免疫抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種西尼羅河病...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：方端，
申請(專利權(quán))人：方端，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44