本發明專利技術公開了檢測E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，它采用其堿基序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示的VP1基因，表達的VP1蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的多克隆抗體為捕獲抗體，采用其堿基序列如序列表SEQ?ID?NO.3所示的VP2基因，表達的VP2蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的單克隆抗體，并標記了辣根過氧化物酶（HRP）。安全性、與RT-PCR檢測結果具有100%符合率。試劑盒4℃保存6個月，檢測結果與常規方法無明顯差異。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬生物
，具體涉及檢測E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑 盒。
技術介紹
牛腸道病毒(Bovine enterovirus，BEV)與人脊髓灰質炎病毒、人柯薩奇病毒、人 腸道致細胞病變孤兒病毒，豬腸道病毒等同屬小RNA病毒科腸道病毒屬中的成員，它所引起 的傳染病給養牛業造成嚴重的經濟損失。牛腸道病毒感染臨床上以發熱、流淚、咳嗽、流鼻 涕、呼吸困難和嚴重腹瀉為主要特征。本病自上世紀50年代首次由Moll等報道以來，其他國 家也相繼報道有本病發生。國內李英利等于2011年首次從內蒙某奶牛場的犢牛糞便樣品中 分離到一株F種腸道病毒，證實國內牛群中存在BEV感染。彭小薇等于2013年從北京地區某 發生嚴重腹瀉的奶牛也分離出一株F種牛腸道病毒。申請人于2012年從吉林長春地區爆發 的一種臨床上以呼吸困難和嚴重腹瀉，高發病率和高致死率為主要特征的不明疫病中首次 發現分離出E種腸道病毒HY12,確定了國內牛群存在E種腸道病毒感染。該病在國內為新發 傳染病，嚴重威脅養牛業的健康發展。有關BEV感染的診斷方法，尤其是具有特異、敏感、快 速與簡便、適于在基層牛場應用的檢測腸道病毒抗原的方法和試劑盒鮮有報道。
技術實現思路
本專利技術目的是提供一種檢測E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒。 一種E種腸道病毒抗原捕獲抗體，它是采用其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示 的VPl基因，表達VPl蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的多克隆抗體。 -種E種腸道病毒酶標抗體，是采用其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 3所示的VP2 基因，表達VP2蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的單克隆抗體。 所述的一種E種腸道病毒酶標抗體標記了辣根過氧化物酶。 檢測E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，它的抗原捕獲抗體為上述的一 種E種腸道病毒抗原捕獲抗體，酶標抗體為上述的一種E種腸道病毒酶標抗體。 本專利技術提供了檢測E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，它采用其堿基序 列如序列表SEQ ID NO. 1所示的VPl基因，表達的VPl蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的多克隆 抗體為捕獲抗體，采用其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 3所示的VP2基因，表達的VP2蛋白， 免疫BALB/C小鼠后制備的單克隆抗體，并標記了辣根過氧化物酶(HRP)。安全性、與RT-PCR 檢測結果具有100%符合率。試劑盒4°C保存6個月，檢測結果與常規方法無明顯差異。 本專利技術的優點： 1、 具有生物安全性。試劑盒所用的抗E種腸道病毒VPl和VP2的高免抗體為原核載體表 達的重組蛋白誘導BALB/C小鼠產生，不含E種腸道病毒，因此不存在散毒危險； 2、 敏感性高。捕獲抗體和HRP標記二抗均具有很高的免疫效價，因此提高了試劑盒的敏 感性和特異性。試劑盒檢測E種腸道病毒陽性和陰性糞便樣品與RT-PCR檢測結果具有100% 符合率； 3、 特異性強。試劑盒與其他病原體無交叉反應，只檢出E種腸道病毒抗原，具有很高特 異性； 4、 穩定性好。試劑盒4°C保存6個月，檢測結果與常規方法無明顯差異，具有很好的穩定 性； 5、 快速簡便。試劑盒2.0-2.5 h即可報告結果，使用方便，一般技術人員按說明書即可 操作，條件一般實驗室均可進行； 6、 不影響動物正常生產。待檢樣品為糞便，采集容易、方便、不影響動物正常生產，容易 被基層牛場接受； 7、 價格便宜。約3元/頭份，HRP標記二抗和抗體制備技術成熟，均可大規模獲得。【附圖說明】圖I PGEX-4T-1-VP1 和PGEX-4T-1-VP2重組質粒酶切鑒定（泳道2、3:pGEX-4T-1-VPl;泳道5、6: PGEX-4T-1-VP2;泳道1、7: PGEX-4T-1 質粒陰性對照；泳道4: DNA分子marker); 圖2重組蛋白的SDS-PAGE檢測結果(泳道3: pGEX-4T-1-VP 1重組菌未誘導總蛋白；泳道 2:pGEX-4T-1-VPl重組菌誘導后總蛋白；泳道4:pGEX-4T-1-VP2重組菌未誘導總蛋白；泳道 5:pGEX_4T-l_VP2重組菌誘導后總蛋白；泳道1、6:蛋白分子marker); 圖3純化重組蛋白的SDS-PAGE檢測結果(VP1重組蛋白BSA;VP2重組蛋白BSA); 圖4 E種腸道病毒VPl和VP2抗體免疫熒光鑒定； 圖5試劑盒各組分（（1)包被有VP1捕獲抗體及預處理的96孔ELISA板；（2)樣品稀釋液； (3)20倍濃縮洗滌液；（4)HRP標記抗VP2 IgG; (5)終止液；（6)底物A; (7)底物B; (8)陽性對照 樣品；（9)陰性對照樣品）。【具體實施方式】實施例1 E種腸道病毒結構蛋白VPl和VP2原核表達重組質粒的構建 1、 引物設計 根據目標序列的堿基組成，分別設計引物擴增VPl和VP2基因的引物，上下游分別含有 BamHI、EcoR頂每切位點。引物序列如下： 擴增VPl序列引物：2、 基因擴增 常規Trizol法提取E種腸道病毒的基因組RNA，采用市售常規反轉錄試劑盒，按照說明 操作獲得cDNA，并以其為模板分別擴增了 VPl基因和VP2基因，PCR反應體系：PCR 運行條件：94°C 預變性 2min;94°C 變性 lmin、54°C 退火 30sec、72°C 延伸 30sec，共 30 個循環;72°C再延伸5min。反應結束后，取IyL進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 3、目標基因與pGEX-4T-l的連接、轉化 采用分子生物學領域中的常規酶切、連接等技術，構建重組質粒PGEX-4T-1-VP1和 PGEX-4T-1-VP2,并采用CaCl2法將重組質粒轉化大腸桿菌DH5a感受態中。利用含100 yg/mL 氨芐霉素的LB培養平板篩選陽性克隆，并進行常規增菌培養，收獲菌體，提取質粒，進行 BamHI/EcoRI雙酶切鑒定，如圖1所示。 實施例2 VPl和VP2重組蛋白的表達及純化 將鑒定的陽性重組質粒PGEX-4T-1-VP1和pGEX-4T-1-VP2轉化BL21(DE3)感受態細胞 后，挑取單個菌落接種到3 mL含有100 yg/rnL氨芐霉素的LB液體培養基中培養過夜，然后取 I mL上述培養物接種到200 mL含有100 yg/rnL氨芐霉素的LB液體培養基中37°C振搖培養至 對數生長期（OD6QQ=O . 6~0.8)，加入IPTG至終濃度為I mmol/L，20°C誘導培養3 h，經SDS-PAGE檢測，獲得了重組目標蛋白VPl和VP2,如圖2所示。離心沉淀菌體，超聲破碎后以尿素純 化包涵體方法獲得高純度的重組蛋白，如圖3所示。實施例3抗VPl鼠源多克隆抗體和VP2單克隆抗體的制備與純化 1、 抗VPl鼠源多抗制備:選擇6-8周齡健康BALB/C小鼠，以弗氏完全佐劑乳化純化的VPl 重組蛋白，每只小鼠多點皮下注射共100 yg，之后每間隔14 d按照同樣方法加強免疫一次， 同時采集血清檢測效價。最后一次加強免疫采用直接腹腔注射100 yg純化的蛋白，3~5 d后 采集血液收集血清，即為抗VPl鼠源多抗； 2、 抗VP2單克隆抗體制備：免疫方法同抗VPl鼠源多抗制備本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種E種腸道病毒抗原捕獲抗體，它是采用其堿基序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示的VP1基因，表達VP1蛋白，免疫BALB/C小鼠制備的多克隆抗體。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王新平，邢澤黎，朱利塞，郭昌明，蓋小春，王明月，魯海冰，曹玉峰，劉亞靜，張群，
申請(專利權)人：吉林大學，
類型：發明
國別省市：吉林;22
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