銅綠假單胞菌B血清型脂多糖的抗體制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供對銅綠假單胞菌具有優(yōu)異抗菌活性的新型抗體。通過使用從具有慢性銅綠假單胞菌肺部感染的囊性纖維化患者得到的成漿細(xì)胞作為初始材料，成功得到與B血清型銅綠假單胞菌株的LPS結(jié)合且在體內(nèi)和體外具有優(yōu)異抗菌活性的抗體。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及銅綠假單胞菌B血清型脂多糖的抗體及其應(yīng)用。更具體地，本專利技術(shù)涉及特異性結(jié)合銅綠假單胞菌株B血清型脂多糖的抗體，以及含有任何該抗體的藥物組合物、銅綠假單胞菌感染診斷劑和銅綠假單胞菌檢測試劑盒。
技術(shù)介紹
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是廣泛且主要分布于自然環(huán)境如土壤和水中的革蘭氏陰性需氧桿菌。銅綠假單胞菌是通常不引起健康受試者致病的非致病細(xì)菌(avirulent bacterium),所述健康受試者對銅綠假單胞菌具有中度的抗體效價以及足夠 的免疫功能。然而，一旦體弱患者感染銅綠假單胞菌，銅綠假單胞菌可引起嚴(yán)重癥狀，其可導(dǎo)致所述患者死亡。為此，銅綠假單胞菌作為醫(yī)院感染和機(jī)會感染的主要病原菌引人矚目，因此預(yù)防和治療銅綠假單胞菌感染已經(jīng)是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要問題。為預(yù)防或治療銅綠假單胞菌感染，已經(jīng)主要使用抗生素或合成抗菌劑。然而，銅綠假單胞菌產(chǎn)生了對這些藥物的抗藥性，因此這種藥物在許多情況下無法提供足夠的治療作用。特別地，使用抗生素等治療耐多藥銅綠假單胞菌(MDRP)的感染很難且有限制。為此，作為替代方法，已經(jīng)開始進(jìn)行使用免疫球蛋白制劑的治療。同時，已經(jīng)檢驗了使用銅綠假單胞菌的抗體預(yù)防或治療銅綠假單胞菌感染。例如，已經(jīng)開發(fā)了各自與特定血清型銅綠假單胞菌株特異性結(jié)合的抗體(專利文獻(xiàn)1-5，以及非專利文獻(xiàn)I和2)。然而，到目前為止開發(fā)的銅綠假單胞菌的抗體在銅綠假單胞菌感染的預(yù)防或治療中尚無法提供足夠的作用。引用列表專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I日本未審查專利申請公開號平6-178688專利文獻(xiàn)2日本未審查專利申請公開號平6-178689專利文獻(xiàn)3日本未審查專利申請公開號平7-327677專利文獻(xiàn)4國際公開號W02004/101622專利文獻(xiàn)5國際公開號W02006/084758非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)IThe Journal of Infectious Diseases, 152，6，1985，1290-1299.非專利文獻(xiàn)2Journal of General Microbiology, 133, 1987, 3581-3590.
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
技術(shù)問題鑒于上述情況作出本專利技術(shù)，且本專利技術(shù)的一個目標(biāo)是提供對銅綠假單胞菌具有優(yōu)異抗菌活性的新型抗體。本專利技術(shù)的一個主要目標(biāo)是提供與銅綠假單胞菌株B血清型脂多糖特異性結(jié)合的抗體。技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本專利技術(shù)采用以下方法。首先，從慢性銅綠假單胞菌肺部感染的囊性纖維化患者和健康志愿者采集血液樣本。借助如下手段鑒定具有高比例的對脂多糖(下文中有時簡稱為“LPS”)特異的成漿細(xì)胞的供體樣本(I)測定血液循環(huán)中成漿細(xì)胞和漿細(xì)胞的量的FACS分析；(2)測定血液循環(huán)中細(xì)胞量的ELISP0T分析，所述細(xì)胞制造對特定LPS抗原特異的抗體；和(3)測定存在或不存在對特定LPS抗原特異的免疫球蛋白的ELISA分析。下一步，由所述鑒定的供體樣本制備識別LPS的抗體。具體地，通過對⑶19、⑶38、λ-輕鏈和死細(xì)胞染色選擇存活成漿細(xì)胞。在選出的成漿細(xì)胞上，通過包括多重重疊延伸RT-PCR和后續(xù)巢式PCR的兩步PCR從相同B細(xì)胞獲得編碼重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的成對DNA序列(圖I )。下一步，將擴(kuò)增的DNA插入篩選載體，并隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichia coli)中。從所述大腸桿菌純化擴(kuò)增載體的集合。將得到的抗體庫在動物培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)。通過ELISA篩選編碼結(jié)合至純化的LPS分子的抗體的克隆，并選出LPS特異的克隆。隨后，測定所選出克隆的堿基序列。隨后，對由這樣得到的克隆所編碼的抗體檢測其各種活性、其血清型特異性和抗原表位。 作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所確定的抗體與銅綠假單胞菌B血清型LPS結(jié)合，并在體外和體內(nèi)具有優(yōu)異抗菌活性。具體地，本專利技術(shù)涉及與銅綠假單胞菌B血清型LPS結(jié)合的抗體，其表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌活性。本專利技術(shù)也涉及該抗體的用途。更具體地，本專利技術(shù)提供[I]識別銅綠假單胞菌脂多糖的B帶LPS的抗體，其與B血清型銅綠假單胞菌株的表面充分結(jié)合，但不與A、C、D、E、F、G、H、I和M血清型銅綠假單胞菌株的表面的任一種充分結(jié)合。[2]根據(jù)第I條所述的抗體，其具有對B血清型銅綠假單胞菌株的調(diào)理素活性。[3]根據(jù)第2條所述的抗體，其中對ATCC 33349標(biāo)識的銅綠假單胞菌株的調(diào)理素活性的EC50為5 μ g/ml或更少。[4]根據(jù)第2條所述的抗體，其中對ATCC 27578和ATCC BAA-47中的任一個標(biāo)識的銅綠假單胞菌株的調(diào)理素活性的EC50為I μ g/ml或更少。[5]根據(jù)第I至4條的任一條所述的抗體，其具有對B血清型銅綠假單胞菌株的凝集活性。[6]根據(jù)第5條所述的抗體，其中對ATCC BAA-47標(biāo)識的銅綠假單胞菌株的單位量(μ g) IgG的凝集效價為1000或更大。[7]根據(jù)第I至6條的任一條所述的抗體，其對B血清型銅綠假單胞菌株的全身性感染具有抗菌作用。[8]根據(jù)第7條所述的抗體，其中對全身性感染ATCC 27578標(biāo)識的銅綠假單胞菌株的中性白細(xì)胞減少癥小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于青霉酮(Venilon)的1/300。[9]根據(jù)第7條所述的抗體，其中對全身性感染ATCC BAA-47標(biāo)識的銅綠假單胞菌株的中性白細(xì)胞減少癥小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于青霉酮(Venilon)的1/100。[10]具有下列(a)和(b)特征任一個的抗體(a)包括包括記載于SEQ ID NO: I至3的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID No: I至3的氨基酸序列并且其中至少一個序列的一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的輕鏈可變區(qū)，和包括記載于SEQ ID N0:4至6的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID N0:4至6的氨基酸序列并且其中至少一個序列的一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的重鏈可變區(qū)；(b)包括 包括記載于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列并且其中至少一個序列的一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的輕鏈可變區(qū)，和包括記載于SEQ ID NO: 12至14的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID NO: 12至14的氨基酸序列并且其中至少一個序列的一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的重鏈可變區(qū)。[11]具有下列(a)和(b)特征任一個的抗體(a)包括包括記載于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列并且其中一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的輕鏈可變區(qū)，和包括記載于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID N0:8的氨基酸序列并且其中一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的重鏈可變區(qū)；以及(b)包括包括記載于SEQ ID NO: 15的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID NO: 15的氨基酸序列并且其中一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的輕鏈可變區(qū)，和包括記載于SEQ ID NO: 16的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID NO: 16的氨基酸序列并且其中一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的重鏈可變區(qū)。[12]含有抗體的輕鏈或輕鏈可變區(qū)的肽，該肽具有下列(a)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2010.02.18 JP 2010-0334291.一種抗體，其識別銅綠假單胞菌脂多糖的B帶LPS，且與B血清型銅綠假單胞菌株的表面充分結(jié)合，但不與A、C、D、E、F、G、H、I和M血清型銅綠假單胞菌株表面的任何一種充分結(jié)合。2.根據(jù)權(quán)利要求I的抗體，其對B血清型銅綠假單胞菌株具有調(diào)理素活性。3.根據(jù)權(quán)利要求2的抗體，其中對ATCC33349標(biāo)識的銅綠假單胞菌株的調(diào)理素活性的EC50為5μ g/ml或更少。4.根據(jù)權(quán)利要求2的抗體，其中對ATCC27578和ATCC BAA-47的任一者標(biāo)識的銅綠假單胞菌株的調(diào)理素活性的EC50為I μ g/ml或更少。5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一權(quán)利要求的抗體，其具有對B血清型銅綠假單胞菌株的凝集活性。6.根據(jù)權(quán)利要求5的抗體，其中單位量(μg) IgG對ATCC BAA-47標(biāo)識的銅綠假單胞菌株的凝集效價為1000或更大.7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一權(quán)利要求的抗體，其對B血清型銅綠假單胞菌株的全身性感染具有抗菌作用。8.根據(jù)權(quán)利要求7的抗體，其中對全身性感染ATCC27578標(biāo)識的銅綠假單胞菌株的中性白細(xì)胞減少癥小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于青霉酮的1/300。9.根據(jù)權(quán)利要求7的抗體，其中對全身性感染ATCCBAA-47標(biāo)識的銅綠假單胞菌株的中性白細(xì)胞減少癥小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于青霉酮的1/100。10.具有下列(a)和(b)特征任意之一的抗體 Ca)包括 包括記載于SEQ ID NO: I至3的氨基酸序列或包括記載于SEQID NO: I至3的氨基酸序列并且其中至少一個序列的一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的輕鏈可變區(qū)，和 包括記載于SEQ ID N0:4至6的氨基酸序列或包括記載于SEQID N0:4至6的氨基酸序列并且其中至少一個序列的一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的重鏈可變區(qū)；和 (b)包括 包括記載于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列并且其中至少一個序列的一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的輕鏈可變區(qū)，和 包括記載于SEQ ID NO: 12至14的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID NO: 12至14的氨基酸序列并且其中至少一個序列的一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的重鏈可變區(qū)。11.具有下列(a)和(b)特征任意之一的抗體 Ca)包括 包括記載于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列并且其中一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的輕鏈可變區(qū)，和 包括記載于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID NO:8的氨基酸序列并且其中一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的重鏈可變區(qū)；以及(b)包括 包括記載于SEQ ID NO: 15的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID NO: 15的氨基酸序列并且其中一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或插入的輕鏈可變區(qū)，和 包括記載于SEQ ID NO: 16的氨基酸序列或包括記載于SEQ ID NO: 16的氨基酸序列并且其中一個或多個氨基酸被置換、刪除、添加和/或...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：田中二朗，P·S·安德森，奧富隆文，稻葉常良，大冢圭子，赤羽宏友，星名由佳利，長曽宏，熊谷正志，
申請(專利權(quán))人：明治制果藥業(yè)株式會社，西福根有限公司，
類型：
國別省市：