一種E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法技術

本發明專利技術公開了一種E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法，包括如下步驟：(1)將E型產氣莢膜梭菌菌種接種于無菌血平皿培養基上，厭氧培養，進行菌株的復蘇；(2)將復蘇后的E型產氣莢膜梭菌菌種接種于液體硫乙醇酸鹽流體培養基中，厭氧條件下進行増菌，制得種子液；(3)將種子液接種于產毒培養基中，厭氧培養，制備得到外毒素液；(4)將制備的外毒素液經滅活、乳化處理，再加入硫柳汞，即制備得到E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗。本發明專利技術開發制備了免疫力強，無毒副作用的E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗。該疫苗可以有效預防由此菌導致的犢牛，羔羊痢疾等疾病。

A preparation method of E type Clostridium perfringens toxoid vaccine

The invention discloses a preparation method of Clostridium perfringens type E toxoid vaccine, which comprises the following steps: (1) the Clostridium perfringens type E strains were inoculated in sterile blood agar medium, anaerobic culture, strain recovery; (2) after resuscitation from Clostridium perfringens type E Clostridium strains were inoculated in the liquid fluid thioglycollate medium for bacteria under anaerobic conditions, prepared seed liquid; (3) the seed was inoculated in the toxin producing medium, anaerobic culture, prepared exotoxin solution; (4) was prepared by liquid inactivated exotoxin, emulsion at Daniel, adding thimerosal, which was prepared by Clostridium perfringens type E toxoid vaccine. The invention has developed and prepared E type Clostridium perfringens toxoid vaccine with strong immunity and no side effect. The vaccine can effectively prevent diseases such as calves, lamb dysentery and other diseases caused by the bacteria.

【技術實現步驟摘要】
一種E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法
本專利技術涉及獸用生物制品
，具體涉及一種E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法。
技術介紹
產氣莢膜梭菌，舊稱魏氏梭菌，根據其產生的4種主要外毒素(α，β，ε，ι)，將產氣莢膜梭菌分為A，B，C，D，E五個毒素型型。Bohenel指出：“魏氏梭菌致病是由于它們形成分泌的毒素和代謝產物，無毒素產生就不會出現臨床癥狀”。作為該菌成員之一的E型產氣莢膜梭菌主要分泌α和ι外毒素。盡管在動物生產中很少有典型癥狀有關E型產氣莢膜梭菌病，仍然有報告指出E型產氣莢膜梭菌占到所有產氣莢膜梭菌分離株的5％，同時5％的E型產氣莢膜梭菌能與50％的牛致死性溶血性腸炎有關。并且E型產氣莢膜梭菌主要侵襲羔羊，犢牛等反芻動物。20世紀初，在英國，報道了犢牛和羔羊的ι毒素腸毒血癥的發生，在那時已經有報道一定數量的牛溶血性，壞死性腸炎即痢疾的發生，并且從發病的綿羊和牛也檢測到了E型菌株和ι毒素。在巴西，E型產氣莢膜梭菌在分離的菌株中占比比較大，在健康和腹瀉的牛中接近30％的樣品攜帶有ι毒素，其中有9％的牛會發生猝死。同時E型菌也可以感染多個物種，從具有腸毒血癥臨床癥狀的山羊，鹿，野豬中，也分離到了E型產氣莢膜梭菌菌株。因此，為了預防E型產氣莢膜梭菌對犢牛、羔羊的潛在危害，有必要對E型產氣莢膜梭菌的疫苗進行研究。產氣莢膜梭菌形成的主要外毒素的化學成分為蛋白質，具有較好的免疫原性。因此，根據產氣莢膜梭菌的發病機理，制備不同類別的產氣莢膜梭菌毒素，將其滅活后做成類毒素疫苗，用于畜禽預防和治療，能夠達到確實可靠的免疫和治療效果。目前已有關于A型-D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗制備的報道，但關于E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備，迄今仍未見報道。
技術實現思路
針對上述現有技術，本專利技術的目的是提供一種E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法。為實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：一種E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法，包括如下步驟：(1)將E型產氣莢膜梭菌菌種接種于無菌血平皿培養基上，厭氧培養，進行菌株的復蘇；(2)將復蘇后的E型產氣莢膜梭菌菌種接種于液體硫乙醇酸鹽流體培養基中，厭氧條件下進行増菌，制得種子液；(3)將種子液接種于產毒培養基中，厭氧培養，過濾除菌，制備得到外毒素液；(4)將制備的外毒素液經滅活、乳化處理，再加入硫柳汞，即制備得到E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗。優選的，步驟(1)中，所述E型產氣莢膜梭菌菌種采用的標準菌種E型NCTC8084(NationalCollectionofTypeCultures，英國微生物菌種保藏中心)。該菌株可通過現有技術中的常規渠道直接獲得。該菌株經多次試驗，與其他E型產氣莢膜梭菌菌株相比，產毒效果最佳。優選的，步驟(1)中，所述無菌血平皿培養基由如下方法制備而成：將3.8g血瓊脂基礎，1g葡萄糖，溶于100mL的去離子水中，121℃，15min高壓滅菌，冷卻至50℃，加入5mL脫纖維綿羊血，搖晃均勻，傾入滅菌的平皿，即得。優選的，步驟(1)中，厭氧培養的溫度為37℃，厭氧培養的時間為36h。優選的，步驟(2)中，41℃厭氧培養18h進行増菌。不同類型的產氣莢膜梭菌其増菌培養的條件是存在明顯差異的，針對E型產氣莢膜梭菌，本專利技術對其増菌培養的溫度和時間條件進行了優化考察，結果發現，溫度過高或溫度過低都不利于E型產氣莢膜梭菌的生長，培養時間過短，會使増菌效果不顯著；培養時間過長則會影響菌株后期的產外毒素。當培養溫度為41℃，培養時間為18h時，其増菌效果最優。優選的，步驟(3)中，所述產毒培養基由如下方法制備而成：2g蛋白胨，1g糊精，2g酵母提取物，1.2gL-精氨酸溶于100mLPBS緩沖液，用濃鹽酸調pH為7.5，高壓滅菌，即得。優選的，步驟(3)中，厭氧培養的條件為：43℃厭氧振蕩培養6h。進一步優選的，厭氧培養時，厭氧條件的氣體構成按體積分數為：88％N2、5％CO2、7％H2。在產毒培養基中進行厭氧培養以制備外毒素液，是制備E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的關鍵步驟，因為在相同佐劑條件下，疫苗免疫效果往往與毒素含量呈正比，毒素含量越高，疫苗效果越好。由于不同類型的產氣莢膜梭菌分泌毒素的條件是不同的，彼此間難以進行借鑒或參考，針對E型產氣莢膜梭菌外毒素液的制備，本專利技術從產毒培養基的營養成分、pH條件、厭氧培養的溫度、時間以及厭氧條件的氣體組成等進行了探索，結果發現，本專利技術的產毒培養基特別符合E型產氣莢膜梭菌分泌毒素對營養成分的需求，本專利技術以商品化的蛋白胨、酵母提取物等成品作為原材料替代原有的質量不可控的牛肉、牛肝等原材料，通過篩選培養基配方并優化產毒素的培養條件，使培養基的產毒能力得到極大的提高，而且產毒性能穩定、質量可控、配制使用方便、價格低廉。pH條件也是影響毒素產量的關鍵因素，pH為7.5時的毒素產量最高，pH低于或高于7.5都會降低毒素的產量。更為關鍵的是，厭氧培養的溫度和時間條件，雖然在細菌生長適宜溫度范圍內，提高培養溫度有利于菌體的生長，但菌體生長和細菌產毒分屬不同的階段，最有利于菌體生長的培養溫度不一定能夠獲得最高的毒素產量，經多次試驗摸索發現，43℃厭氧振蕩培養6h能夠獲得最高的毒素產量。另外，厭氧環境的氣體組成對于E型產氣莢膜梭菌生長和分泌毒素都會產生影響，如果該氣體成分發生改變如混合氣體成分比例發生改變，就會導致E型產氣莢膜梭菌不生長，同時也不會分泌毒素。優選的，步驟(4)中，滅活采用的方法為：向外毒素液中加入甲醛，使其終濃度為0.3％，置于37℃，充分振蕩，轉速為140rmp，滅活24h。由于不同類型的產氣莢膜梭菌所分泌的外毒素存在不同，導致對外毒素液進行滅活的處理條件存在差異，對外毒素液進行滅活處理的效果主要與甲醛的濃度、溫度、滅活的時間等有關，采用高濃度的甲醛和高溫滅活，雖然能使滅活時間減少，但對抗原的損失也較大；滅活時間過短，會使滅活不充分，滅活時間過長，一方面增加了成本，另一方面對抗原也有損失。綜合考慮滅活的效率和對抗原性的影響，本專利技術對滅活條件進行了優選，結果發現，采用0.3％的甲醛、37℃、滅活24h能夠取得最優的滅活效果。優選的，步驟(4)中，向滅活后的外毒素液中加入白油佐劑進行乳化，外毒素液與白油佐劑加入的體積比為1:2。優選的，白油佐劑的構成為：12份白油和1份Span-80混合后，再加入占白油和Span-80混合液總質量1.5％的硬脂酸鋁；白油中正碳數為C16-C20的烷烴所占的質量百分數為10-20％。經多次試驗發現，采用上述構成的白油佐劑制備的疫苗，其抗體效價最高且副作用最小。本專利技術的有益效果：本專利技術首次開發制備了免疫力強，無毒副作用的E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗。該疫苗可以有效預防由此菌導致的犢牛，羔羊痢疾等疾病。具體實施方式應該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本申請所屬
的普通技術人員通常理解的相同含義。為了使得本領域技術人員能夠更加清楚地了解本申請的技術方案，以下將結合具體的實施例詳細說明本申請的技術方案。本專利技術實施例中所用的試驗材料均為本領域常規的試驗材料，均可通過商業渠道購買得到。其中，血瓊脂基礎、硫乙醇酸鹽流體培養基(本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)將E型產氣莢膜梭菌菌種接種于無菌血平皿培養基上，厭氧培養，進行菌株的復蘇；(2)將復蘇后的E型產氣莢膜梭菌菌種接種于液體硫乙醇酸鹽流體培養基中，厭氧條件下進行増菌，制得種子液；(3)將種子液接種于產毒培養基中，厭氧培養，過濾除菌，制備得到外毒素液；(4)將制備的外毒素液經滅活、乳化處理，再加入硫柳汞，即制備得到E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗。

【技術特征摘要】
1.一種E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)將E型產氣莢膜梭菌菌種接種于無菌血平皿培養基上，厭氧培養，進行菌株的復蘇；(2)將復蘇后的E型產氣莢膜梭菌菌種接種于液體硫乙醇酸鹽流體培養基中，厭氧條件下進行増菌，制得種子液；(3)將種子液接種于產毒培養基中，厭氧培養，過濾除菌，制備得到外毒素液；(4)將制備的外毒素液經滅活、乳化處理，再加入硫柳汞，即制備得到E型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗。2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述無菌血平皿培養基由如下方法制備而成：將3.8g血瓊脂基礎，1g葡萄糖，溶于100mL的去離子水中，121℃，15min高壓滅菌，冷卻至50℃，加入5mL脫纖維綿羊血，搖晃均勻，傾入滅菌的平皿，即得。3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，厭氧培養的溫度為37℃，厭氧培養的時間為36h。4.根據權利要求1所述的制備方法...

【專利技術屬性】
技術研發人員：柴同杰，馬連營，郭夢嬌，蔡玉梅，
申請(專利權)人：山東農業大學，
類型：發明
國別省市：山東,37