一種產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗及其生產方法技術

本發明專利技術涉及一種產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗及其生產方法。本發明專利技術制備的產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，系采用經過密碼子優化、含有3個氨基酸突變的重組產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白生產，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空間構象，從而保持其免疫原性，又避免了單個氨基酸突變帶來的生物安全隱患。該疫苗還具有制備工藝簡單、免疫劑量低、疫苗效力遠高于現有疫苗等優點，較我國目前商品化的產氣莢膜梭菌天然毒素滅活疫苗大大降低了疫苗生產過程中的生物安全風險，是我國現行D型產氣莢膜梭菌毒素疫苗升級換代的理想候選疫苗；而且在與其它抗原共同制備聯苗時，無需增大聯苗的使用劑量，即可制備聯苗。

A recombinant subunit vaccine of Clostridium perfringens epsilon toxin and its production method

The present invention relates to a recombinant subunit vaccine of Clostridium perfringens epsilon toxin and its production method. Clostridium perfringens epsilon toxin recombinant subunit vaccine prepared by the invention, the after codon optimization, containing 3 amino acid mutations of recombinant Clostridium perfringens epsilon toxin protein production, that is to maximize the retention of the integrity and conformation of natural toxins, so as to maintain its immunogenicity, and avoid a single amino acid mutation biological safety hidden trouble. The vaccine also has simple preparation process, low dosage, immune vaccine efficacy is much higher than the current vaccine and other advantages, is the commodity of Clostridium perfringens natural toxin inactivated vaccine greatly reduces the risk of biological safety vaccine production process, is an ideal candidate vaccine present of Clostridium perfringens type D toxin the upgrading of the vaccine; and in common with other vaccine antigen preparation, without increasing the dose of vaccine combined vaccine can be prepared.

【技術實現步驟摘要】
一種產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗及其生產方法
本專利技術涉及一種產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗及其生產方法。屬于獸用生物制品領域。
技術介紹
產氣莢膜梭菌也稱魏氏梭菌，是一種重要的人畜共患病，該病原是創傷性氣性壞疽和人類食物中毒以及羊快疫、羔羊痢疾、牛羊壞死性腸炎、牛羊腸毒血癥的主要病原之一，對畜牧業造成了巨大的經濟損失。產氣莢膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素，該菌可產生至少18種外毒素，并通過其產生的毒素發揮致病作用。根據產生4種主要致死性外毒素α、β、ε和ι的種類，將該菌分為A、B、C、D、E五個毒素型。產氣莢膜梭菌病具有發病急、病程短且死亡率極高的特點，一旦發病，往往還來不及治療就因外毒素中毒而發生猝死，因此免疫接種是防控該病的有效方法。目前使用的商品化疫苗主要為滅活疫苗，在預防動物產氣莢膜梭菌病方面雖然取得了一定的效果，但這些疫苗在使用過程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起動物局部炎癥及毒性反應等；其在制備過程中涉及外毒素的滅活，存在毒素外泄或滅活不徹底等生物安全隱患；此外，培養上清中的各種微小毒素以及細菌的代謝產物往往成為免疫動物的致敏原，接種動物易產生不良反應，導致免疫效果下降甚至免疫失敗。因此，開發安全性好、有效抗原含量高、免疫原性強的梭菌毒素基因工程疫苗，是未來的發展方向。ε毒素是由B型和D型產氣莢膜梭菌產生，全長296個氨基酸，以前毒素的形式分泌于菌體外。前毒素被宿主的胰蛋白酶和糜蛋白酶或梭菌自身的蛋白酶作用后，去除N端11-13個以及C端22-29個氨基酸，從而活化為成熟毒素。ε毒素屬于β穿孔素家族成員，是產氣莢膜梭菌毒素中毒力最強的毒素，其毒力僅次于肉毒桿菌素和破傷風神經毒素，是目前已知第三強的梭菌類毒素。因此，實現毒素的減毒甚至無毒以及構建相關減毒或無毒體，對于開發毒素基因工程亞單位疫苗以及其作為抗原組分的多價亞單位疫苗的研究和應用就顯得尤為重要。現有技術中對產氣莢膜梭菌主要外毒素蛋白的表達與純化方法相對復雜，表達產物通常以不溶性的包涵體形式存在，可溶性蛋白表達的報道在國內外非常少。因為包涵體中的表達產物不具有生物學活性，因而需要進行變性與復性處理。蛋白的變性與復性是一個極其復雜的過程，不同蛋白的復性條件各異，復性率往往很難提高，這是限制其應用的主要制約因素。采用可溶性表達方式可很好的克服這一問題。如何構建可溶性表達載體并且優化可溶性蛋白的高效表達方法，是本領域長期以來一直研究的熱點課題。目前雖然已有產氣莢膜梭菌ε毒素減毒突變體的報道，如中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所于力等(“產氣莢膜梭菌ε毒素減毒突變體及其應用”，申請號：201410707351.6)將野生型產氣莢膜梭菌ε毒素成熟毒素的第71位酪氨酸突變為非芳香族氨基酸，獲得了對于細胞或動物體減毒的ε毒素突變體，由于該申請僅突變1個氨基酸，易發生回復突變而重新成為毒力極強的毒素，從而給未來實際的疫苗大規模生產帶來嚴重的生物安全風險。中國動物疫病預防控制中心宋曉暉等(“抑制產氣莢膜梭菌感染的重組ε蛋白及其制備方法與應用”，申請號：201610301989.9)設計了3種重組ε毒素蛋白，但均缺失了野生型ε毒素蛋白的前50個氨基酸殘基，這種采用蛋白片段作為免疫原的策略，很可能會導致抗原蛋白的抗原性不完整，從而影響其免疫原性。本專利技術制備的產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，系采用經過密碼子優化、含有3個氨基酸突變的重組產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白生產，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空間構象，從而保持其免疫原性，又避免了單個氨基酸突變帶來的生物安全隱患。同時，該疫苗還具有制備工藝簡單、免疫劑量低、免疫效力好等優點，是我國現行D型產氣莢膜梭菌毒素疫苗升級換代的理想候選疫苗。
技術實現思路
本專利技術目的在于制備出產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，用于預防由B型和D型產氣莢膜梭菌感染引起的疾病。本專利技術技術方案1.一種產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大腸桿菌表達的重組產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白；制苗用菌種為重組表達產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白的大腸桿菌被命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21/mETX-HYY株，該菌株已于2017年09月21日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCCNo.14652。2.本專利技術所述產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，其特征在于所述重組產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白，與野生型產氣莢膜梭菌ε毒素成熟毒素相比，含有3個氨基酸突變，分別為第30位酪氨酸突變為丙氨酸，第106位組氨酸突變為脯氨酸，以及第196位酪氨酸突變為丙氨酸。3.本專利技術所述產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，其特征在于所述重組產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白，其重組表達載體的基因序列經過密碼子優化，更易于在大腸桿菌中實現高表達。4.本專利技術所述產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，其特征在于所述重組產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白為無毒突變體，大大降低了疫苗生產過程中的生物安全風險。5.本專利技術所述產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，其特征在于所述重組產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白，在大腸桿菌BL21(DE3)中為可溶性表達，既可最大限度地保留天然毒素蛋白的空間構象，從而保持其免疫原性；又避免了包涵體變性復性的繁瑣工藝對抗原蛋白免疫原性的影響，減少了疫苗的制備時間和生產成本。6.本專利技術所述產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，其特征在于所述重組產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白，其C端含有6組氨酸(6His)標簽，便于蛋白的純化。7.本專利技術所述產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗的制備方法，其特征在于用所述表達產氣莢膜梭菌ε毒素重組蛋白的埃希氏大腸菌BL21/mETX-HYY株作為疫苗生產菌株，經發酵培養、誘導表達、菌體破碎、可溶性抗原蛋白分離純化后，加雙相油乳佐劑混合制成。本專利技術具體實施方式1.產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗的制備(1)菌種：制苗用菌種為重組表達產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21/mETX-HYY株，該菌種表達的產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白含有3個氨基酸突變(分別為第30位酪氨酸突變為丙氨酸，第106位組氨酸突變為脯氨酸以及第196位酪氨酸突變為丙氨酸)、C端含有6組氨酸(6His)標簽。該菌株已于2017年09月21日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCCNo.14652；由中國獸醫藥品監察所鑒定、保管和供應。(2)一級種子繁殖及鑒定：將凍干菌種用少量LB液體培養基融解，劃線接種于含卡那霉素的LB固體平板，置37℃培養12～16小時，選取符合標準的單個菌落，接種含卡那霉素的LB液體培養基，置37℃培養8～12小時，與50％甘油等比例混合后分裝，經純粹檢驗合格后，作為制苗用一級種子。(3)二級種子繁殖及鑒定：取一級種子，按1％的量接種含卡那霉素的LB液體培養基，置37℃振蕩培養8～12小時，即為二級種子。(4)制苗用抗原制備：取合格的二級種子，按培養基總量的2％接種含卡那霉素的LB液體培養基，發酵罐內培養。設置培養參數為：培養溫度3本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大腸埃希氏菌表達的重組產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白；制苗用菌種為重組表達產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白的大腸埃希氏菌，被命名為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)BL21/mETX?HYY株，該菌株已于2017年09月21日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCC?No.14652。

【技術特征摘要】
1.一種產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大腸埃希氏菌表達的重組產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白；制苗用菌種為重組表達產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白的大腸埃希氏菌，被命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21/mETX-HYY株，該菌株已于2017年09月21日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCCNo.14652。2.如權利要求1所述產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，其特征在于所述重組產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白，與野生型產氣莢膜梭菌ε毒素成熟毒素相比，含有3個氨基酸突變，分別為第30位酪氨酸突變為丙氨酸，第106位組氨酸突變為脯氨酸，以及第196位酪氨酸突變為丙氨酸。3.如權利要求1所述產氣莢膜梭菌ε毒素重組亞單位疫苗，其特征在于所述重組產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白，其重組表達載體的基因序列經過密碼子優化，更易于在大腸桿菌中實現高表達。...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳小云，杜吉革，朱真，薛麒，王磊，印春生，李啟紅，康凱，姚文生，
申請(專利權)人：中國獸醫藥品監察所，
類型：發明
國別省市：北京,11