細粒棘球蚴重組BCG疫苗及制備方法技術

本發明專利技術提供了一種細粒棘球蚴重組BCG疫苗的制備；本疫苗具有熱穩定性好，便于運輸和保存，單次免疫就可誘導高效價的針對“靶抗原”的抗體，免疫力持久，免疫次數少，簡化了免疫程序，增強了針對細粒棘球蚴病的免疫效果。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術提供了一種細粒棘球絳蟲重組BCG疫苗，用于預防控制動物細粒棘球蝴病，同時還提供了該疫苗的制備方法，屬于疫苗制備

技術介紹
棘球蝴病(cystic echinococcosis, CE)是一種嚴重危害人們身體健康的人畜共患寄生蟲病，已成為農牧民因病致貧，因病返貧的主要因素之一。目前對包蟲病患者進行包蟲囊摘除術是首選的治療方法。但手術對人體帶來的損傷比較大且有可能復發，化療藥物可產生一些嚴重的不良反應。因此，需要研究更有效的解決方法，而疫苗預防是防治其流行的有效措施。預防細粒棘球蝴病的疫苗經歷了多肽疫苗，亞單位疫苗，DNA疫苗等多種探索，隨著生物技術的發展，重組活疫苗的制備得到了一種新的方法。基因重組卡介苗(rBCG)是借助基因工程技術，將外源基因導入BCG中構建而成的多價疫苗(rBCG)，可誘導長期的體液免疫和細胞免疫，近幾年的研究結果已顯示出rBCG具有非常好的應用前景，有望發展成為預防疾病的一種實際可用的新型疫苗。本專利技術小組曹春寶等從細粒棘球蝴中克隆了 egGlY162抗原基因。結果顯示，egGlY162基因不論是在基因序列上，還是在氨基酸序列及蛋白結構上均與國外研究者已研發出的用于終末宿主保護的候選疫苗emY162有高度的相似性，很可能也是終末宿主的保護性抗原。雖然使用BCG構建多價疫苗在本領域已經熟知，但影響疫苗效率的因素有很多，如何研發出預防棘球蝴病的 高效疫苗仍然是亟待解決的技術問題。
技術實現思路
本專利技術提供了一種細粒棘球絳蟲重組BCG疫苗，為穿梭表達載體細粒棘球絳蟲重組BCG疫苗，具有熱穩定性好，便于運輸和保存，免疫力持久，免疫次數少，免疫程序簡化，增強了針對細粒棘球蝴病的免疫效果。生產成本少，便于生產等特點。本專利技術還公開了細粒棘球絳蟲重組BCG疫苗的制備方法，以利于工業化生產。本專利技術重組細粒棘球絳蟲BCG疫苗的解決方案如下首先獲得細粒棘球絳蟲保護性抗原基因，進行TA克隆，將測序正確的目的片段酶切回收，再與經同樣酶切的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體PMV361相連，構建重組表達載體，將重組表達載體電轉化入BCG,經抗性篩選和PCR擴增篩選得到陽性抗細粒棘球絳蟲重組BCG克隆。本專利技術所提供的重組細粒棘球絳蟲BCG疫苗的制備方法，其包括如下步驟(I)合成上游和下游引物上游引物5'-CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3'；下游引物5'-CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3'；(2)目的基因egGlY162的PCR擴增以細粒棘球蝴cDNA為模板，采用上述的上下游引物，進行PCR擴增，擴增體系為滅菌水 16 μ 1，質粒 2μ 1，EcoRI O. 5 μ 1，Hind III 0. 5μ I, mix 20 μ 1，共 40 μ I 擴增體系；Touchdown PCR 反應條件95°C 4 min ；95°C 30s，65°C 30s 降 1°C，72°C 2min 共 11 個循環；95°C 30s, 50°C 30s, 75°C 2min 共 25 個循環；最后 72°C 延伸，7min，末次 4°C，將 PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到大小為360bp的目的條帶；(3)目的片段egGlY162與載體PMV361的連接egGlY162擴增產物經DNA純化試劑盒純化回收后先與PMD19-T載體連接，利用α互補原則篩選陽性克隆并進行PCR擴增鑒定、酶切鑒定和測序鑒定，將經上述鑒定正確的陽性克隆擴增后提取egGlY162-PMD19質粒，將該質粒經EcoR1、Hind III限制性內切酶酶切，凝膠回收目的片段后與同樣用EcoRI和Hind III進行雙酶切的pMV361質粒膠回收產物，按3 :1的摩爾比(目的片段載體)在T4DNA連接酶的催化下進行連接，連接體系為buffer 緩沖液 I μ 1，目的片段 7 yl，PMV361 載體 I μ I，T4DNA 連接酶 I μ1，*10μ1的連接體系，16°C，連接過夜。轉化入E. coli DH5 α感受態細胞后，利用PMV361質粒所攜帶的卡那霉素抗性篩選egGlY162-PMV361重組子，對陽性克隆進行PCR擴增鑒定和EcoRI和Hind III雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒命名為egGlY162-PMV361 ；(4)重組egGlY162_PMV361載體的電轉化將_80°C保存的BCG菌株復蘇后接種于含10% OADC的7H9液體培養基，180r /min，37°C，震蕩培養至對數生長期，即培養液變混濁，沙樣生長后用于感受態細胞的制備。取在7H9液體培養基上 生長良好的BCG培養物，37°C繼續震蕩培養10天，4°C，5000r/min離心IOmin收集菌體，以滅菌10%甘油洗滌4次，最后一次用適量的10%甘油重懸菌體，即得到BCG感受態細胞。分別將egGlY162-PMV361質粒及空質粒pMV361經電穿孔法分別轉化入BCG感受態細胞中，具體電轉化條件為電容25Uf，電阻1000Ω，場強18X105V/ m，轉化時間為5 ms，轉化次數為3 ;放電結束后將100 μ L菌液立即轉移入I mL 7H9液體培養液中，37°C震蕩培養過夜(>24h)。取培養過夜的轉化后菌液800r/min室溫離心lOmin，取沉淀100 μ L均勻涂布于含OADC和30 μ g/ml卡那霉素的7H10固體培養基表面，37°C培養3-4周，培養基表面見轉化后菌落生長。從7H10固體培養基平板表面挑取BCG重組子，接種于罕OADC的7H9液體培養基中，37°C，培養至對數生長期，取菌液進行PCR擴增鑒定證實為陽性克隆后，分別命名為egGlY162-PMV361-rBCG及PMV361- rBCG ；(5)重組 egGlY162-PMV361-rBCG 的誘導表達將經PCR擴增鑒定證實含有egGlY162-PMV361質粒的rBCG陽性克隆接種在含30 μ g/ml卡那霉素的7H9液體培養基中，37°C，180r/min振搖培養至對數生長期(需3w左右)，進行45°C熱誘導45min，離心收集菌體；加入Iml預冷的磷酸鹽緩沖液重懸菌泥后超聲粉碎，再加入等體積2XSDS-PAGE上樣緩沖液，10(TC煮沸5min，冰浴5min，4°C，12000rpm離心 5min ;取 10 μ I 上清進行 SDS-PAGE 分析，最終獲得的 egGlY162_PMV361_rBCG表達的融合抗原，其分子量約為71KD。 使用穿梭表達載體細粒棘球絳蟲重組BCG疫苗egGlY162-PMV361-rBCG免疫小鼠后，不同程度的提高了小鼠的免疫水平。具體表現為在使用重組BCG疫苗egGlY162-PMV361-rBCG免疫小鼠后，小鼠體內的特異性抗體水平、細胞因子等免疫指標均隨著免疫時間和次數的增加而升高，與BCG組合空白對照組相比差異有統計學意義(P〈0. 05);免疫后進行攻蟲實驗顯示，經重組BCG疫苗egGlY162-PMV361-rBCG免疫小鼠體內的囊泡大體變化與空白對照組相比，囊數量減少，體積變小，部分囊表面混濁，部分囊壁塌陷，游離于腹腔，或附著于腸系膜或肝表面。囊濕重抑制率為68本文檔來自技高網...

【技術保護點】
重組細粒棘球絳蟲BCG疫苗的制備方法，其包括如下步驟：（1）合成上游和下游引物：上游引物：5′?CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT?3′；下游引物：5′?CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA?3′；（2）目的基因egG1Y162的PCR擴增：以細粒棘球蚴cDNA為模板，采用上述的上下游引物，進行PCR擴增，擴增體系為：滅菌水16μl，質粒2μl，EcoRI?0.5μl，HindⅢ?0.5μl，mix?20μl，共40μl擴增體系；Touchdown?PCR反應條件：95℃?4?min；95℃?30s，65℃?30s?降1℃，72℃?2min?共11個循環；95℃?30s，50℃?30s，75℃?2min?共25個循環；最后72℃?延伸，7min，末次4℃，將PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到大小為360bp的目的條帶；（3）目的片段egG1Y162與載體PMV361的連接：egG1Y162擴增產物經DNA純化試劑盒純化回收后先與PMD19?T載體連接，利用α互補原則篩選陽性克隆并進行PCR擴增鑒定、酶切鑒定和測序鑒定，將經上述鑒定正確的陽性克隆擴增后提取egG1Y162?PMD19質粒，將該質粒經EcoRI、HindⅢ?限制性內切酶酶切，凝膠回收目的片段后與同樣用EcoRI和HindⅢ進行雙酶切的pMV361質粒膠回收產物，按3∶1的摩爾比(目的片段∶載體)在T4DNA連接酶的催化下進行連接，連接體系為：buffer緩沖液1?μl，目的片段7?μl，PMV361載體1?μl?，T4?DNA連接酶1?μl，共10μl的連接體系，16℃，連接過夜。轉化入E.coli?DH5α感受態細胞后，利用PMV361質粒所攜帶的卡那霉素抗性篩選egG1Y162?PMV361重組子，對陽性克隆進行PCR擴增鑒定和EcoRI和HindⅢ雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒命名為egG1Y162?PMV361；（4）重組egG1Y162?PMV361載體的電轉化將?80℃保存的BCG菌株復蘇后接種于含10%?OADC的7H9液體培養基，?180r／min?，37℃?，震蕩培養至對數生長期，即培養液變混濁,?沙樣生長后用于感受態細胞的制備。取在7H9液體培養基上生長良好的BCG培養物，?37℃繼續震蕩培養10天，4℃，5000?r/min離心10min?收集菌體，以滅菌10%甘油洗滌4次，最后一次用適量的10%甘油重懸菌體，即得到BCG感受態細胞。分別將egG1Y162?PMV361質粒及空質粒pMV361經電穿孔法分別轉化入BCG感受 態細胞中，具體電轉化條件為：電容25Uf，電阻1000Ω，場強18×105V/?m?，轉化時間為5?ms，轉化次數為3；放電結束后將100μL菌液立即轉移入1?mL?7H9液體培養液中，37℃震蕩培養過夜（>24h）。取培養過夜的轉化后菌液800r/min室溫離心10min，取沉淀100μL均勻涂布于含OADC和30μg/ml卡那霉素的7H10固體培養基表面，?37℃培養3?4周，培養基表面見轉化后菌落生長。從7H10固體培養基平板表面挑取BCG重組子，接種于罕OADC的7H9液體培養基中，?37℃?，培養至對數生長期，取菌液進行PCR擴增鑒定證實為陽性克隆后，分別命名為egG1Y162?PMV361?rBCG及PMV361??rBCG；（5）重組egG1Y162?PMV361?rBCG的誘導表達將經PCR擴增鑒定證實含有egG1Y162?PMV361質粒的rBCG陽性克隆接種在含30μg/ml?卡那霉素的7H9液體培養基中，37℃，180r/min振搖培養至對數生長期(需3w左右)，進行45℃熱誘導45min，離心收集菌體；加入1ml預冷的磷酸鹽緩沖液重懸菌泥后超聲粉碎，再加入等體積2×SDS?PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5min，冰浴5min，4℃，12000rpm離心5min；取10μl上清進行SDS?PAGE分析，最終獲得的egG1Y162?PMV361?rBCG表達的融合抗原，其分子量約為71KD。...

【技術特征摘要】
1.重組細粒棘球絳蟲BCG疫苗的制備方法，其包括如下步驟(1)合成上游和下游引物上游引物5' -CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3'；下游引物5' -CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3'；(2)目的基因egGlY162的PCR擴增以細粒棘球蝴cDNA為模板，采用上述的上下游引物，進行PCR擴增，擴增體系為滅菌水 16 μ 1，質粒 2 μ 1，EcoRI O. 5 μ I, HindIII O. 5 μ I, mix 20 μ 1，共 40 μ I 擴增體系; Touchdown PCR 反應條件95°C 4 min ；95°C 30s, 65°C 30s 降 1°C，72°C 2min 共 11 個循環；95°C 30s, 50°C 30s, 75°C 2min 共 25 個循環；最后 72°C 延伸，7min，末次 4°C，將 PCR 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到大小為360bp的目的條帶；(3)目的片段egGlY162與載體PMV361的連接egGlY162擴增產物經DNA純化試劑盒純化回收后先與PMD19-T載體連接，利用α互補原則篩選陽性克隆并進行PCR擴增鑒定、酶切鑒定和測序鑒定，將經上述鑒定正確的陽性克隆擴增后提取egGlY162-PMD19質粒，將該質粒經EcoR1、Hind III限制性內切酶酶切， 凝膠回收目的片段后與同樣用EcoRI和Hind III進行雙酶切的pMV361質粒膠回收產物， 按3 :1的摩爾比(目的片段載體)在T4DNA連接酶的催化下進行連接，連接體系為 buffer 緩沖液 I μ 1，目的片段 7 yl，PMV361 載體 I μ I，T4DNA 連接酶 I μ1，*10μ1 的連接體系，16°C，連接過夜。轉化入E. coli DH5 α感受態細胞后，利用PMV361質粒所攜帶的卡那霉素抗性篩選egGlY162-PMV361重組子，對陽性克隆進行PCR擴增鑒定和EcoRI 和Hind III雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒命名為egGlY162-PMV361 ；(4)重組egGlY...

【專利技術屬性】
技術研發人員：丁劍冰，馬海梅，祖力皮也·吐爾遜，馬秀敏，曹春寶，德里夏提·依米提，朱明，溫浩，
申請(專利權)人：新疆醫科大學，
類型：發明
國別省市：