一種犢牛腸毒血癥產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗的制備方法技術

本發明專利技術涉及動物細菌學領域，提供了一種犢牛腸毒血癥產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗的制備方法，該疫苗以產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素培養液和滅菌后的白油佐劑按1:1的比例加入到產氣莢膜梭菌類毒素培養液中并進行乳化，制成產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗，該疫苗治療效果好、免疫能力強、且無毒副作用，可用于免疫妊娠期母牛以及剛出生犢牛，可以預防犢牛的腸毒血癥。

Preparation of a beta 2 toxin toxoid vaccine of Clostridium perfringens from calf enterotoxemia

The present invention relates to the field of Animal Microbiology preparation method, provides a calf intestinal toxemia of Clostridium perfringens beta 2 toxin toxoid vaccine, the vaccine with Clostridium perfringens and sterilized liquid white oil adjuvant added by the ratio of 1:1 to C. porringers fungus toxin in culture solution and emulsion 2 toxin toxoid culture, made of Clostridium perfringens beta 2 toxin toxoid vaccine, the vaccine has good treatment effect, immune ability, and non-toxic side effects, can be used for pregnant cows and immune newborn calves, can prevent calf intestinal toxemia.

【技術實現步驟摘要】
一種犢牛腸毒血癥產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗的制備方法
本專利技術涉及動物細菌學領域，本專利技術提供了一種犢牛腸毒血癥產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗的制備方法。
技術介紹
產氣莢膜梭菌是一種廣泛存在于自然界的革蘭氏陽性厭氧菌，可產生多達17種外毒素，其中主要的有α、β1、β2、ε等毒素，根據所產毒素分為A、B、C、D、E5種毒素型。在A、B、C、D型產氣莢膜梭菌中均發現了β2毒素，越來越多的研究表明：牛的腸毒血癥尤其是犢牛的腸毒血癥與產β2毒素的產氣莢膜梭菌有關。由產氣莢膜梭菌引起的牛腸毒血癥的致病機理在于：牛腸道內的產β2毒素的產氣莢膜梭菌大量增殖從而產生大量的β2毒素，該毒素對小腸粘膜上皮細胞具有強烈的細胞毒性，破壞腸壁，引起毒血癥。因此預防該病應以控制β2毒素為重點。類毒素疫苗是用失去毒性而保留免疫原性的毒素所制成的疫苗，其可以有效的針對產氣莢膜梭菌外毒素引起的疾病。然而，目前還沒有針對產氣莢膜梭菌β2毒素制備的類毒素疫苗，
技術實現思路
本專利技術針對現有技術存在的空白，提供了一種犢牛腸毒血癥產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗及其制備方法，該疫苗以產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素培養液和滅菌后的白油佐劑按1:1的比例加入到產氣莢膜梭菌類毒素培養液中并進行乳化，制成產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗，該疫苗治療效果好、免疫能力強、且無毒副作用，可用于免疫妊娠期母牛以及剛出生犢牛，可以預防犢牛的腸毒血癥。專利技術人在本專利技術中所采用的C型產氣莢膜梭菌采用現有菌種，特別選自保藏于NationalCollectionofTypeCultures英國微生物菌種保藏中心，保藏號：NCTC4989的標準菌株，可通過現有渠道直接獲得，故而該生物材料屬于現有技術中可直接獲得的材料，不需進行單獨的生物保藏。本專利技術的具體技術方案如下：具體步驟如下：(1)、將標準菌株接種約2-5μL于血瓊脂基礎平板培養基上，41℃復蘇36h，復蘇后挑取血平板上的單菌落接種于7mL液體硫乙醇酸鹽培養基，39℃增菌厭氧培養12h，得到產氣莢膜梭菌菌液；將7mL產氣莢膜梭菌菌液加入到100mLGordon湯產毒培養基中，厭氧環境下43℃培養6h高效產毒，然后4℃8000rpm離心30min，取上清，用孔徑0.22μm的蔡氏濾器過濾除菌，得到含β2毒素的產氣莢膜梭菌外毒素培養液；(2)、在上述獲得的β2外毒素培養液中加入體積比0.3％的甲醛，充分振蕩混勻后置于37℃持續滅活5天，得到產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素培養液；(3)、將上述β2毒素類毒素培養液中加入tween-80，使其終濃度達到2wt％，搖晃均勻，得到水相；將白油佐劑滅菌，得到油相；將油相按體積比1:1的比例加入到水相中，然后在組織粉碎機中進行乳化三次，每次10min，制成產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗。其中所述的血瓊脂基礎平板培養基為1g葡萄糖和3.8g豆瓊脂粉溶于100ml蒸餾水滅菌后，加入5ml綿羊血獲得；所述的Gordon湯產毒培養基為：每100mLPBS緩沖液溶解3g胰蛋白胨、2g糊精、2g酵母浸粉和2.2gL-精氨酸；疫苗的無菌檢驗參照《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》(2001年版)附錄301頁進行，結果無菌生長。疫苗的安全檢驗用體重2kg-3kg的家兔4只，各自皮下注射上述獲得的產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗5mL，觀察30天，接種動物均健康存活且注射處未出現感染、壞死等病理變化。具體使用時，皮下注射，母牛分娩前2個月首次接種，犢牛出生后4周接種一次，2周后再加強免疫一次，免疫劑量每次5mL，結果證實疫苗所產生的抗體效價最高可達1：3200。綜上所述，本專利技術所獲得的疫苗以產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素培養液和滅菌后的白油佐劑按1:1的比例加入到產氣莢膜梭菌類毒素培養液中并進行乳化制成，該疫苗治療效果好、免疫能力強、且無毒副作用，可用于免疫妊娠期母牛以及剛出生犢牛，可以預防犢牛的腸毒血癥。具體實施方式實施例一種犢牛腸毒血癥產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗的制備方法，具體步驟如下：(1)、將標準菌株接種2-5μL于血瓊脂基礎平板培養基，41℃復蘇36h，復蘇后使用液體硫乙醇酸鹽培養基,39℃增菌厭氧培養12h，得到產氣莢膜梭菌菌液；將7mL產氣莢膜梭菌菌液加入到100mLGordon湯產毒培養基中，厭氧環境下43℃培養6h高效產毒，然后4℃8000rpm離心30min，取上清，用孔徑0.22μm的蔡氏濾器過濾除菌，得到含β2毒素的產氣莢膜梭菌外毒素培養液；(2)、在上述獲得的β2外毒素培養液中加入體積比0.3％的甲醛，充分振蕩混勻后置于37℃持續滅活5天，得到類毒素培養液；(3)、將β2毒素類毒素培養液加入tween-80，使其終濃度達到2％，搖晃均勻，得到水相；將白油佐劑滅菌，得到油相。將油相按體積比1:1的比例加入到水相中，然后在組織粉碎機中進行乳化三次，每次10min，制成產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗；其中所述的血瓊脂基礎平板培養基為1g葡萄糖和3.8g豆瓊脂粉溶于100ml蒸餾水滅菌后，加入5ml綿羊血獲得；所述的Gordon湯產毒培養基為：每100mLPBS緩沖液溶解3g胰蛋白胨、2g糊精、2g酵母浸粉和2.2gL-精氨酸；疫苗的無菌檢驗參照《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》(2001年版)附錄301頁進行，無菌生長。疫苗的安全檢驗用體重2kg-3kg的家兔4只，各自皮下注射產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗5mL，觀察30天，接種動物均健康存活且注射處未出現感染、壞死等病理變化。實驗例疫苗效果檢驗用山東高速生物工程奶牛場的50kg以上的健康易感犢牛10只，其中8只犢牛每只皮下注射產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗5mL；2周后以相同的途徑和劑量進行第二次接種，作為疫苗免疫組，以飼養管理完全相同的2只犢牛皮下注射5mL的生理鹽水為空白對照。對10只犢牛每隔一周進行頸靜脈采血，檢測血清中β2毒素抗體效價。疫苗免疫組的血清中抗體效價于第四周達到最高為1：3200，空白對照組的血清未檢測到抗體，結果如下表所示：疫苗免疫組犢牛血清抗體效價檢測結果可見本專利技術所獲得的疫苗治療效果好、免疫能力強、且無毒副作用，可用于免疫妊娠期母牛以及剛出生犢牛，可以預防犢牛的腸毒血癥。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種犢牛腸毒血癥產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：(1)、將標準菌株接種2?5μL于血瓊脂基礎平板培養基上，41℃復蘇36h，復蘇后挑取血平板上的單菌落接種于7mL液體硫乙醇酸鹽培養基，39℃增菌厭氧培養12h，得到產氣莢膜梭菌菌液；將7mL產氣莢膜梭菌菌液加入到100mL?Gordon湯產毒培養基中，厭氧環境下43℃培養6h高效產毒，然后4℃8000rpm離心30min，取上清，用孔徑0.22μm的蔡氏濾器過濾除菌，得到含β2毒素的產氣莢膜梭菌外毒素培養液；(2)、在上述獲得的β2外毒素培養液中加入體積比0.3％的甲醛，充分振蕩混勻后置于37℃持續滅活5天，得到產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素培養液；(3)、將上述β2毒素類毒素培養液中加入tween?80，使其終濃度達到2wt％，搖晃均勻，得到水相；將白油佐劑滅菌，得到油相；將油相按體積比1:1的比例加入到水相中，然后在組織粉碎機中進行乳化三次，每次10min，制成產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗。

【技術特征摘要】
1.一種犢牛腸毒血癥產氣莢膜梭菌β2毒素類毒素疫苗的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：(1)、將標準菌株接種2-5μL于血瓊脂基礎平板培養基上，41℃復蘇36h，復蘇后挑取血平板上的單菌落接種于7mL液體硫乙醇酸鹽培養基，39℃增菌厭氧培養12h，得到產氣莢膜梭菌菌液；將7mL產氣莢膜梭菌菌液加入到100mLGordon湯產毒培養基中，厭氧環境下43℃培養6h高效產毒，然后4℃8000rpm離心30min，取上清，用孔徑0.22μm的蔡氏濾器過濾除菌，得到含β2毒素的產氣莢膜梭菌外毒素培養液；(2)、在上述獲得的β2外毒素培養液中加入體積比0.3％的甲醛，充分振蕩混勻后置于37℃持續滅活5天，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡玉梅，高晟斌，宋志剛，王曉宇，李慶雷，
申請(專利權)人：山東農業大學，
類型：發明
國別省市：山東,37