修飾的肌氨酸氧化酶,制備方法及其試劑組合物技術

修飾的肌氨酸氧化酶，其是一種在構成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中通過添加、刪除、插入或置換至少一個氨基酸而轉化的蛋白質，特征為具有肌氨酸氧化酶活性和與轉化前的蛋白相比具有改進的液體穩定性。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】,制備方法及其試劑組合物的制作方法
本專利技術涉及通過以蛋白工程技術修飾具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白而得到的肌氨酸氧化酶，其特征在于具有在改進的液體穩定性，優異的底物特異性和對脯氨酸的作用降低，以及生產肌氨酸氧化酶的方法和使用其的試劑組合物。
技術介紹
肌氨酸氧化酶(EC 1.5.3.1)作為一種酶，與其他酶，如肌酐酶、肌酸酶和過氧化物酶一起用于檢測體液內肌酸和肌酐，它們是診斷肌肉疾病和腎病的臨床指示物。肌氨酸氧化酶在有水和氧氣的情況下作用于作為底物的肌酸，產生甘氨酸、甲醛和過氧化氫。已知肌氨酸氧化酶通過芽孢桿菌屬(Bacillus)(JP-54-52789-A，JP-61-162174-A)，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(J.Biochem.89599，1981)，柱孢屬(cylindrocarpon)(JP-56-92790-A)，假單孢菌屬(pseudomonas)(JP-60-43379-A)和節桿菌屬(arthrobacter)(JP-2-265478-A)的細菌產生。利用例如帶有通過基因工程技術從這些細菌獲得的肌氨酸氧化酶基因的大腸桿菌宿主，大規模生產肌氨酸氧化酶的技術已經有報道(JP-5-115281-A，JP-6-113840-A，JP-8-238087-A)。伴隨近來的液體臨床診斷試劑，液體中試劑組分的各種穩定化方法已經被研究，并且對用作檢測肌酐和肌酸試劑的肌氨酸氧化酶，一種在液體中具有優異的穩定性的酶是渴望得到的。我們小組之前曾報道通過蛋白工程方式修飾野生型肌氨酸氧化酶而改進其突變型對金屬離子的穩定性(參見，如，JP-7-163341)，但考慮到診斷試劑的長期儲存穩定性，還期待有更多的改進。此外，已知常規的肌氨酸氧化酶還對脯氨酸作用，其是出現在血液中的一種氨基酸，并已有指出它能導致在肌酐和肌酸測量時真實的或假的差異(Rinsho kagaku，20144-152，1991；Seibutsu Shiryo Bunseki，17332-337，1994)。為解決上述問題，我們小組報道了通過蛋白工程方式修飾野生型肌氨酸氧化酶而具有對脯氨酸作用降低的肌氨酸氧化酶(JP-10-248572-A)，但其對原始底物肌酸的作用還不清楚，還需要有更多的改進。本專利技術的目的是提供具有改進的液體穩定性的。本專利技術的另一個目的是提供具有對脯氨酸低反應性和具有優異的底物特異性的肌氨酸氧化酶。本專利技術的另一個目的是提供具有對脯氨酸作用降低的肌氨酸氧化酶。
技術實現思路
作為完成上述目的的廣泛研究的結果，本專利技術人發現肌氨酸氧化酶經修飾后具有改進的液體穩定性或具有對脯氨酸的作用降低同時不破壞其對肌酸的作用。此外，本專利技術人發現肌氨酸氧化酶能被修飾以保持與肌酸的高親和力和具有對脯氨酸的作用降低，因此完成本專利技術。換句話說，本專利技術由下列部分組成。，其是一種在構成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中通過添加、刪除、插入或置換至少一個氨基酸而轉化的蛋白質，特征為具有肌氨酸氧化酶活性和與轉化前的蛋白相比具有改進的液體穩定性。根據的，其特征在于構成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中至少一個氨基酸被其他氨基酸替換。根據的，其中具有肌氨酸氧化酶活性的該蛋白具有與SEQ ID NO1的氨基酸序列50％或更多的同源性。根據的，其中具有肌氨酸氧化酶活性的該蛋白具有與SEQ ID NO1的氨基酸序列80％或更多的同源性。根據的，其中具有肌氨酸氧化酶活性的該蛋白具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的155到250位的相應區域中至少一個氨基酸被其他氨基酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的82到92或354到366位的相應區域中至少一個氨基酸被其他氨基酸替換。根據的，其特征在于選自相應SEQ IDNO1氨基酸序列的89，155，166，204，213，233，240，250和364位中至少一個氨基酸被其他氨基酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的89位賴氨酸被精氨酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的155位半胱氨酸被異亮氨酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的166位天冬酰胺被賴氨酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的204位甲硫氨酸被丙氨酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的213位絲氨酸被脯氨酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的233位半胱氨酸被絲氨酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的240位天冬酰胺被酪氨酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的250位谷氨酸被谷氨酰胺替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的364位丙氨酸被纈氨酸替換。，其為一種在構成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中通過添加、刪除、插入或置換至少一個氨基酸而轉化的蛋白質，特征為具有肌氨酸氧化酶活性和與轉化前的蛋白相比對L-脯氨酸作用降低。根據的，其特征在于構成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中至少一個氨基酸被其他氨基酸替換。根據的，其中具有肌氨酸氧化酶活性的該蛋白具有與SEQ ID NO1的氨基酸序列50％或更多的同源性。根據的，其中具有肌氨酸氧化酶活性的該蛋白具有與SEQ ID NO1的氨基酸序列80％或更多的同源性。根據的，其中具有肌氨酸氧化酶活性的該蛋白具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的82到152和216到328位的相應區域中至少一個氨基酸被其他氨基酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的82到97和313到328位的相應區域中至少一個氨基酸被其他氨基酸替換。根據的，其特征在于選自相應SEQID NO1氨基酸序列的89，94和322位中至少一個氨基酸被其他氨基酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的89位賴氨酸被精氨酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的94位纈氨酸被甘氨酸替換。根據的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的322位賴氨酸被精氨酸替換。根據的，其特征在于修飾后肌氨酸氧化酶的Km值在未修飾酶的3倍以內。根據的，其特征在于修飾后肌氨酸氧化酶的Km值在未修飾酶的1.5倍以內。肌氨酸氧化酶，其特征在于37℃和pH8.0條件下測量具有至少下列一個特征對L-脯氨酸作用基于肌酸為0.7％或更低；和L-脯氨酸的Km值150mM或更多。根據的肌氨酸氧化酶，其特征在于37℃和pH8.0條件下測量具有至少下列一個特征對L-脯氨酸作用基于肌酸為0.5％或更低；和L-脯氨酸的Km值200mM或更多。根據的肌氨酸氧化酶，其中肌酸的Km值為10mM或更低。根據的肌氨酸氧化酶，其中肌酸的Km值為5mM或更低。編碼到和到任一項的的基因。含有的基因的載體。轉化有的載體的轉化子。生產的方法，特征在于培養的轉化子和從培養物中收集肌氨酸氧化酶。生產底物特異性優異的的方法，特征在于培養具有到任一項的肌氨酸氧化酶的生產能力的微生物和從培養物中收集肌氨酸氧化酶。含有到和到和到任一項的肌氨酸氧化酶的用于本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】

【專利技術屬性】
技術研發人員：岸本高英，曾我部敦，岡正則，
申請(專利權)人：東洋紡織株式會社，
類型：發明
國別省市：