定量檢測肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法及檢測試劑盒技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種定量檢測肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法及檢測試劑盒，本發(fā)明專利技術(shù)在原有肌氨酸氧化酶分光光度檢測法的基礎(chǔ)上，著重改善原有方法靈敏度不足以滿足臨床檢測的缺點(diǎn)。選用目前檢測靈敏度較高、穩(wěn)定性較好的色原物質(zhì)，使用雙試劑檢測法，合理分配各反應(yīng)物質(zhì)在整體反應(yīng)體系中的濃度，檢測吸光度數(shù)據(jù)讀取時(shí)采用固定時(shí)間點(diǎn)讀取法。使檢測靈敏度較以往分光光度檢測法大大提升。因此，使得本檢測方法既保留了以往分光光度檢測法成本低、可在全自動(dòng)生化儀上使用的優(yōu)點(diǎn)外，也改善其檢測靈敏度低的缺點(diǎn)，使目前的檢測靈敏度提升到10-7～10-6mol/L，已能滿足臨床檢測的需求。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種定量檢測肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法及檢測試劑盒。
技術(shù)介紹
目前用于檢測肌氨酸的方法主要有液相色譜或氣象色譜與質(zhì)譜聯(lián)用檢測法、肌氨酸氧化酶熒光檢測法、毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測法、肌氨酸氧化酶分光光度檢測法。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測法雖然檢測靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均較高，但由于色譜-質(zhì)譜設(shè)備昂貴，檢測成本較高，檢測速度慢，很難大批量檢測，且操作復(fù)雜一般人很難掌握。因此，常應(yīng)用于科研，很難應(yīng)用臨床大樣本量診斷檢測。 肌氨酸氧化酶熒光檢測法、毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測法其檢測靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度略低于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測法，但也可滿足臨床的需求。此兩種方法的檢測成本較色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測法已大大降低，但在檢測時(shí)仍需購置專門的檢測裝置，如熒光檢測器、毛細(xì)光電泳儀等專門設(shè)備。并且人工操作的部分很高，對應(yīng)用于常規(guī)臨床檢測來講仍有一定的難度。肌氨酸氧化酶分光光度檢測法，其檢測成本低、可應(yīng)用于目前任何一種全自動(dòng)生化分析儀，可應(yīng)用于臨床高速大樣本量的檢測需要。但由于以往的色原靈敏度低，造成該方法的靈敏度很難滿足臨床的需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本專利技術(shù)的目的在于提供一種成本低、靈敏度高的定量檢測肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法，本專利技術(shù)的另一目的是提供一種肌氨酸檢測試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)定量檢測肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法，具體為D肌氨酸+Η2θ+θ2議乂化》^甘氨酸+甲酸+H2O2;2)Η202+4-氨基安替比林+色原——— 醌亞胺類有色物質(zhì)+H2O;反應(yīng)結(jié)束后有醌亞胺類有色物質(zhì)生成造成吸光度的變化，并且該吸光度的變化與肌氨酸的濃度成正比，以檢測得到的樣本吸光度值與校準(zhǔn)曲線對比，得到相應(yīng)的樣本濃度數(shù)值；其中，一試劑Rl濃度為緩沖液50-100mmol/L，4-氨基安替比林2-4mmol/L，過氧化物酶>20KU/L ;二試劑R2濃度為緩沖液50-1OOmmoI/L，色原3-5mmol/L，肌氨酸氧化酶5-10KU/L ;R1/R2試劑比例為3/1-4/1，肌氨酸樣本與總體試劑量的比例為1/25 1/20。進(jìn)一步，所述緩沖液包括Tris-HCL緩沖液、磷酸鹽緩沖液或N-三羥基代甲基-3-氨基丙磺酸緩沖液，緩沖液PH值為7. (T9. O。進(jìn)一步，所述色原包括N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3_甲基苯胺鈉鹽(TOOS)或N，N-雙(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二鈉鹽(TODB)或N- (2-羥基-3-磺丙基)-3’ 5- 二甲氧基苯胺鈉鹽(HDAOS)。進(jìn)一步，不同所述色原所采用的檢測主波長不同，副波長均使用相同的700nm波長。進(jìn)一步，所述TOOS所采用的檢測主波長為550-570nm，所述TODB所采用的檢測主波長為530-540nm，所述HDAOS所采用的檢測主波長為580_590nm。進(jìn)一步，所述步驟I)、2)反應(yīng)溫度為3(T40°C，反應(yīng)時(shí)間控制在8-10分鐘，吸光度監(jiān)測點(diǎn)控制在加入R2試劑后3(Γ66秒開始監(jiān)測反應(yīng)吸光度值直至反應(yīng)結(jié)束。一種用于實(shí)施上述非診斷性方法的肌氨酸檢測試劑盒，包括的試劑及其濃度為一試劑 Rl 緩沖液50_100mmol/L ；4-氨基安替比林2_4mmol/L ; 過氧化物酶>20KU/L;二試劑 R2 緩沖液50-1OOmmo I/L ；色原3_5mmol/L ；肌氨酸氧化酶5-10KU/L。進(jìn)一步，所述緩沖液包括Tr i s-HCL緩沖液、磷酸鹽緩沖液或N-三羥基代甲基-3-氨基丙磺酸緩沖液，緩沖液PH值為7. (T9. O。進(jìn)一步，所述色原包括N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3_甲基苯胺鈉鹽(TOOS)或N，N-雙(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二鈉鹽(TODB)或N- (2-羥基-3-磺丙基)-3’ 5- 二甲氧基苯胺鈉鹽(HDAOS)。本方法在原有肌氨酸氧化酶分光光度檢測法的基礎(chǔ)上，著重改善原有方法靈敏度不足以滿足臨床檢測的缺點(diǎn)，使得本檢測方法既保留了以往分光光度檢測法成本低、可在全自動(dòng)生化儀上使用的優(yōu)點(diǎn)外，也改善其檢測靈敏度低的缺點(diǎn)，使目前的檢測靈敏度提升到10tl0_6mol/L，已能滿足臨床檢測的需求(目前研究表明正常人肌氨酸水平10_6mol/L水平)。附圖說明圖I為實(shí)施例I中的校準(zhǔn)曲線；圖2為實(shí)施例I中的樣本反應(yīng)曲線；圖3為實(shí)施例2中的校準(zhǔn)曲線；圖4為實(shí)施例3中的樣本反應(yīng)曲線。具體實(shí)施例方式下面，參考附圖，對本專利技術(shù)進(jìn)行更全面的說明，附圖中示出了本專利技術(shù)的示例性實(shí)施例。然而，本專利技術(shù)可以體現(xiàn)為多種不同形式，并不應(yīng)理解為局限于這里敘述的示例性實(shí)施例。而是，提供這些實(shí)施例，從而使本專利技術(shù)全面和完整，并將本專利技術(shù)的范圍完全地傳達(dá)給本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員。檢測原理肌氨酸+H20+02 ■g—- 甘氨酸+甲酸+H2O2H202+4-氨基安替比林+色原■■■■■■■■■■ 醌亞胺類有色物質(zhì)+H2O反應(yīng)結(jié)束后有醌亞胺類有色物質(zhì)生成造成吸光度的變化，并且該吸光度的變化與肌氨酸的濃度成正比。反應(yīng)體系中各反應(yīng)物質(zhì)濃度試劑濃度Rl (一試劑)緩沖液50-100mmol/L 4-氨基安替比林2_4mmol/L過氧化物酶>20KU/LR2 (二試劑)緩沖液SOmmoI /I,色原3_5mmol/L肌氨酸氧化酶 5-10KU/L樣本試劑反應(yīng)體積比例R1/R2試劑比例為3/1，樣本與總體試劑量的比例為1/5 1/20。緩沖液反應(yīng)體系用緩沖液可以使Tris-HCL緩沖液、磷酸鹽緩沖液、N-三羥基代甲基-3-氨基丙磺酸緩沖液。緩沖液PH值調(diào)整在7. O 9. O左右。5. 4色原，色原可選用目前的新型色原(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽(TOOS)或N，N-雙(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二鈉鹽(TODB)或N-(2-羥基-3-磺丙基)_3’ 5- 二甲氧基苯胺鈉鹽(HDA0S))。檢測波長不同色原所采用的檢測主波長不同，副波長相同均使用700nm波長，TOOS 550-570nm ；TODB530_540nm ；HDAOS 580_590nm。反應(yīng)溫度最佳反應(yīng)溫度為30 40°C。反應(yīng)時(shí)間與吸光度監(jiān)測時(shí)間反應(yīng)時(shí)間控制在8-10分鐘，吸光度監(jiān)測點(diǎn)控制在加入R2試劑后30 66秒開始監(jiān)測反應(yīng)吸光度值直至反應(yīng)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)步驟I、校準(zhǔn)品配置使用肌氨酸純品配制濃度為6. 25umol/L> 12. 5umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L的溶液最為校準(zhǔn)品溶液。2、空白吸光度值檢測(AO ):I)吸取純水溶液加入Rl試劑溶液,將兩溶液混勻反應(yīng),開始監(jiān)測反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)溫度37 °C。2)待上述溶液反應(yīng)3分鐘后，加入R2試劑溶液，將溶液混勻反應(yīng)，繼續(xù)監(jiān)測反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)溫度37 C。3)待整體反應(yīng)時(shí)間到達(dá)30 66秒后，以不同色原物質(zhì)的最大吸收波長為主波長，以700nm波長為副波長，開始監(jiān)測吸光度值記為A1=A1 ±-A1 ^繼續(xù)監(jiān)測反應(yīng)時(shí)間，待整體反應(yīng)結(jié)束后(8-10分鐘)再次監(jiān)測吸光度值記為A2=A2±-A2ffl。4)吸光度值計(jì)算=Aq=A2-Aiq3、校準(zhǔn)品吸光度值檢測(Asn):I)吸取校準(zhǔn)品溶液加入Rl試劑溶液，將兩溶液混勻反應(yīng)，開始監(jiān)測反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)溫度37 °C。2)待上述溶液反應(yīng)3分鐘后，加入R2試劑溶液，本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
定量檢測肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法，其特征在于，該方法具體為：1）2）反應(yīng)結(jié)束后有醌亞胺類有色物質(zhì)生成造成吸光度的變化，并且該吸光度的變化與肌氨酸的濃度成正比，以檢測得到的樣本吸光度值與校準(zhǔn)曲線對比，得到相應(yīng)的樣本濃度數(shù)值；其中，一試劑R1濃度為：緩沖液50？100mmol/L，4？氨基安替比林2？4mmol/L，過氧化物酶>20KU/L；二試劑R2濃度為：緩沖液50？100mmol/L，色原3？5mmol/L，肌氨酸氧化酶5？10KU/L；R1/R2試劑比例為3/1？4/1，肌氨酸樣本與總體試劑量的比例為1/25~1/20。FDA00002338318700011.jpg,FDA00002338318700012.jpg

【技術(shù)特征摘要】
1.定量檢測肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法，其特征在于，該方法具體為 1)肌氨酸+H20+02-aa8M··__ 甘氨酸 + 甲酸+H2O2; 2)H202+4-氨基安替比林+色原-獲·- 醌亞胺類有色物質(zhì)+H2O; 反應(yīng)結(jié)束后有醌亞胺類有色物質(zhì)生成造成吸光度的變化，并且該吸光度的變化與肌氨酸的濃度成正比，以檢測得到的樣本吸光度值與校準(zhǔn)曲線對比，得到相應(yīng)的樣本濃度數(shù)值； 其中，一試劑Rl濃度為緩沖液50-100mmol/L，4-氨基安替比林2-4mmol/L，過氧化物酶>20KU/L ;二試劑R2濃度為緩沖液50-1OOmmoI/L，色原3-5mmol/L，肌氨酸氧化酶5-10KU/L ;R1/R2試劑比例為3/1-4/1，肌氨酸樣本與總體試劑量的比例為1/25 1/20。2.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述緩沖液包括Tris-HCL緩沖液、磷酸鹽緩沖液或N-三羥基代甲基-3-氨基丙磺酸緩沖液，緩沖液PH值為7. (T9. O。3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述色原包括N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽(TOOS)或N，N-雙(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二鈉鹽(TODB)或N-(2-羥基-3-磺丙基)_3’ 5- 二甲氧基苯胺鈉鹽(HDAOS)。4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，不同所述色原所采用的檢測主波長不同...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：肖飛，劉明，王萌，王大光，許宏濤，鄒麗輝，黃薇，
申請(專利權(quán))人：衛(wèi)生部北京醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：