一種用于平行測定尿嘧啶-DNA糖基化酶和內切酶IV活性的方法及其應用和試劑盒技術

本發明專利技術提供了一種用于平行測定尿嘧啶-DNA糖基化酶和內切酶IV活性的方法及其應用和試劑盒。當目標物為UDG時，若UDG存在，所述發夾探針中的U堿基被移除，產生一個AP位點，產生的AP位點被工具酶EndoIV切刻，釋放出含自由3’末端的引物序列用于引發隨后的滾環放大反應RCA；若UDG不存在時，3’末端被封閉在所述發夾探針，RCA過程不能進行；當目標物為EndoIV時，若EndoIV存在，其RCA過程與上述UDG活性檢測中的RCA過程是一樣的，若EndoIV不存在時，3’末端被封閉在所述發夾探針，RCA過程不能進行。其既能用作UDG的識別探針又能用作EndoIV的前體識別探針，因此簡化了探針的設計。UDG和EndoIV的檢測限分別低至0.00017U/mL和0.11U/mL，結果比其他免標記熒光方法更好或相當。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于醫藥
，尤其涉及一種用于平行測定尿嘧啶-DNA糖基化酶和內切酶IV活性的方法及其應用和試劑盒。
技術介紹
尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和內切酶IV(EndoIV)都是U堿基移除修復(UBER)酶，它們在保持基因組的完整性上具有重要作用。UDG和EndoIV能在修復DNA中的U堿基損傷時發揮協同功能，具體來講，UDG移除U堿基損傷并產生無堿基(AP)位點，隨后EndoIV切刻該AP位點。UBER酶的活性異常將抑制細胞對U堿基損傷的響應，這將導致各種相關疾病，包括免疫缺綜合癥，淋巴瘤，和布魯姆綜合癥。研究表明，UBER酶的活性已成為上述疾病的一種有前途的生物標志物，并且對UBER酶的活性檢測方法代表一種候選工具用于臨床診斷及其功能研究。UBER酶活性的常用檢測方法，包括凝膠電泳法，電化學法和比色法，分別受到放射性危害，復雜的電極修飾過程，或有限靈敏度的局限。作為另一種選擇，熒光法因其安全和靈敏的特點而吸引了人們的廣泛關注。為得到明顯的熒光信號，已發展了許多基于標記的熒光策略用于UBER酶的活性檢測，得到了令人滿意的結果。然而，這些基于標記的熒光策略需要將熒光團或猝滅團共價捕獲到DNA上，導致傳感系統的生物相容性降低并對UBER酶的活性造成不利影響。為解決這個問題，一些免標記的熒光策略已被報道用于UBER酶的活性檢測。含U堿基的DNA探針在UDG引發下能形成G-四倍體(G4)，這種探針已被設計用于UDG活性檢測，并且當G4與金屬復合物或N-甲基-卟啉IX(NMM)綁定時產生免標記的熒光信號。另外，Ma課題組提出了一種利用G4-選擇性的金屬復合物的免標記熒光策略實現了對EndoIV的活性檢測。盡管上述免標熒光策略已實現了對UDG或EndoIV的活性檢測，但是需設計不同的傳感探針以實現對UDG和EndoIV的活性檢測，這增加了探針設計的復雜性。因此，仍需發展一種基于同一探針的新型免標熒光策略用于平行檢測UDG和EndoIV的活性。
技術實現思路
為解決上述問題，本專利技術發展了一種基于一個獨特發夾探針的新型免標記熒光策略用于平行測定UDG和EndoIV的活性(Scheme1)。設計了一個含U堿基和封閉的引物序列的雙功能發夾探針用于目標物的識別和信號轉導。具體講，能發揮作用的RCA引物序列，應是以單鏈形式存在，能與環狀模板雜交而引發RCA反應；而此處封閉的引物序列，是將引物序列設計在發夾結構的環部和頸部中，這樣RCA的引物序列就不是以單鏈形式存在，而是有一部分存在于發夾頸部的雙鏈結構中，因此也就不能與環狀模板雜交而引發RCA反應了，即達到了封閉RCA引物序列的效果。本專利技術的特別之處還在于，目標物的識別方面，這個發夾探針既能用作UDG的識別探針又能用作EndoIV的前體識別探針。Scheme1A(圖9A)闡述了這一策略用于檢測UDG活性的原理，其中發夾探針用作UDG識別探針。UDG存在時，其識別探針中的U堿基被移除，產生一個AP位點。然后，產生的AP位點被工具酶EndoIV切刻，釋放出含自由3’末端的引物序列。此處自由3’末端的引物序列是指，由于發夾頸部被切刻，發夾結構被破壞，導致原來存在于發夾環部和頸部的RCA引物序列此時是以單鏈的形式存在，該單鏈的末端是由于DNA鏈的切刻而產生的3’-OH。)用于引發隨后的滾環放大(RCA)反應。將產生的探針與掛鎖模板和T4DNA連接酶共同孵育之后，phi29DNA聚合酶和dNTPs的加入能引發RCA反應。RCA產物具有大量重復的富含G的序列，它在單價陽離子存在時能折疊成G4結構。當加入NMM時，G4和NMM的強烈相互作用能帶來免標的熒光信號。相反地，當無目標物UDG存在時，引物序列仍被封閉在發夾探針中，因此RCA過程不能進行。另外，當發夾探針用作EndoIV的前體識別探針，這個策略又能被進一步用于EndoIV的活性檢測。如Scheme1B(圖9B)所示，利用工具酶UDG能移除U堿基而產生AP位點的性質，含U堿基的EndoIV的前體識別探針首先被轉換成含AP位點的EndoIV的成熟識別探針。當存在目標物EndoIV時，它能切刻其成熟識別探針中的AP位點，釋放出含自由3’末端的引物序列用于引發RCA反應，該過程與上述UDG活性檢測中的RCA過程是一樣的。由于RCA的信號放大能力，UDG和EndoIV的檢測限分別低至0.00017U/mL、0.11U/mL。相對于它們相應的類似物，本策略對UDG和EndoIV也顯示出更好的選擇性。因此，本策略能提供一種簡單的方法用于定量UDG和EndoIV的活性，有潛力用于臨床診斷和它們的協同功能研究中。本專利技術一方面提供了一種用于平行測定尿嘧啶-DNA糖基化酶和內切酶IV活性的試劑盒，包括：發夾探針和掛鎖模板；所述發夾探針包括環部、頸部，所述頸部連接于環部的兩端且具有互補的核酸序列，所述頸部具有U堿基序列，所述發夾探針具有設計在發夾結構的環部和頸部的RCA的引物序列；所述掛鎖模板具有與自由3’末端的引物序列特異結合引發滾環放大反應的序列。本專利技術中“封閉的序列”，是RCA的引物序列，該序列與后續環狀模板的一部分序列是互補的；其次，3’-OH端存在于每條DNA鏈的一端，此處當發夾頸部被切刻而破壞發夾結構后，原本存在于發夾環部和頸部的RCA引物序列此時以單鏈的形式存在，該單鏈的末端是新形成的3’-OH端。優選的，當目標物為UDG時，若UDG存在，所述發夾探針中的U堿基被移除，產生一個AP位點，產生的AP位點被工具酶EndoIV切刻，釋放出含自由3’末端的引物序列用于引發隨后的滾環放大反應RCA；若UDG不存在時，3’末端序列被封閉在所述發夾探針，RCA過程不能進行；當目標物為EndoIV時，若EndoIV存在，其RCA過程與上述UDG活性檢測中的RCA過程是一樣的，若EndoIV不存在時，3’末端被封閉在所述發夾探針，RCA過程不能進行。優選的，所述發夾探針的序列：GTGGTGAGGAGTGAGGTAGGTGGTATAAACTTAGGATCGTGTGGTTUATACCACCTACCTCACTCCTCACCAC；所述掛鎖模板的序列：GATCCTAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAACCACAC。本專利技術的第二個目的是提供一種用于平行測定尿嘧啶-DNA糖基化酶和內切酶IV活性的方法，包括如下步驟：1)設計發夾探針和掛鎖模板；所述發夾探針包括環部、頸部，所述頸部連接于環部的兩端且具有互補本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于平行測定尿嘧啶?DNA糖基化酶和內切酶IV活性的試劑盒，其特征在于，包括：發夾探針和掛鎖模板；所述發夾探針包括環部、頸部，所述頸部連接于環部的兩端且具有互補的核酸序列，所述頸部具有U堿基序列，所述發夾探針具有設計在發夾結構的環部和頸部的RCA的引物序列；所述掛鎖模板具有與自由3’末端的引物序列特異結合引發滾環放大反應的序列。

【技術特征摘要】
1.一種用于平行測定尿嘧啶-DNA糖基化酶和內切酶IV活性的試劑盒，其特征在于，包
括：發夾探針和掛鎖模板；所述發夾探針包括環部、頸部，所述頸部連接于環部的兩端且具
有互補的核酸序列，所述頸部具有U堿基序列，所述發夾探針具有設計在發夾結構的環部和
頸部的RCA的引物序列；所述掛鎖模板具有與自由3’末端的引物序列特異結合引發滾環放
大反應的序列。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述發夾探針的頸部被切刻、發夾結構被
破壞后，存在于發夾環部和頸部的RCA引物序列以單鏈的形式存在，該單鏈的末端是由于
DNA鏈的切刻而產生的3’-OH，即所述自由3’末端的引物序列。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，當目標物為UDG時，若UDG存在，所述發夾探
針中的U堿基被移除，產生一個AP位點，產生的AP位點被工具酶EndoIV切刻，釋放出含自由
3’末端的引物序列用于引發隨后的滾環放大反應RCA；若UDG不存在時，3’末端被封閉在所
述發夾探針，RCA過程不能進行；當目標物為EndoIV時，若EndoIV存在，其RCA過程與上述UDG
活性檢測中的RCA過程是一樣的，若EndoIV不存在時，3’末端被封閉在所述發夾探針，RCA過
程不能進行。
4.如權利要求1-3任一所述的試劑盒，其特征在于，
所述發夾探針的序列：
GTGGTGAGGAGTGAGGTAGGTGGTATAAACTTAGGATCGTGTGGTTUATACCACCTACCTCACTCCTCACCAC
；
所述掛鎖模板的序列：
GATCCTAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAACCAC
AC。
5.一種用于平行測定尿嘧啶-DNA糖基化酶和內切酶IV活性的方法，其特征在于，包括
如下步驟：
1)設計發夾探針和掛鎖模板；所述發夾探針包括環部、頸部，所述頸部連接于環部的兩
端且具有互補的核酸序列，所述頸部具有U堿基序列，所述發夾探針具有設計在發夾結構的
環部和頸部的RCA的引物序列；所述掛鎖模板具有與自由3’末端的引物序列特異結合引發
滾環放大反應的序列；
2)將步驟1)制備的發夾探針，待檢測的UDG和相應的EndoIV加入到反應緩沖液中，若
UDG存在，所述發夾探針中的U堿基被移除，產生一個AP位點，產生的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：姜瑋，王磊，吳玉姝，
申請(專利權)人：山東大學，
類型：發明
國別省市：山東;37