本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的目的為提供一種用于在診斷現(xiàn)場(chǎng)正確、簡(jiǎn)便且迅速地對(duì)待測(cè)試樣中的糖化血紅蛋白含量進(jìn)行比色定量的多層試驗(yàn)片以及測(cè)量方法。該多層試驗(yàn)片是用于對(duì)糖化血紅蛋白含量進(jìn)行比色定量的多層試驗(yàn)片；至少層疊有下述(a)層和(b)層，所述(a)層和(b)層從待測(cè)試樣點(diǎn)樣面按(a)層、(b)層的順序?qū)盈B；在(a)層和(b)層上承載有過(guò)氧化物酶和氧化還原類(lèi)顯色試劑，且過(guò)氧化物酶和氧化還原類(lèi)顯色試劑分別承載在不同的層上；并且不具有血液分離層，其中，(a)層：至少承載有蛋白酶的高分子基材，(b)層：至少承載有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種用于在診斷現(xiàn)場(chǎng)正確、簡(jiǎn)便且迅速地對(duì)待測(cè)試樣中的糖化血紅蛋白含量進(jìn)行比色定量的多層試驗(yàn)片以及測(cè)量方法。
技術(shù)介紹
測(cè)量糖化蛋白質(zhì)在進(jìn)行糖尿病的診斷、預(yù)防以及治療方面非常重要。糖化蛋白質(zhì)通過(guò)在生物體內(nèi)葡萄糖與血中蛋白質(zhì)的氨基(主要是末端氨基酸的α-氨基、賴(lài)氨酸殘基的Y-氨基)發(fā)生非酶促反應(yīng)而生成。由于蛋白質(zhì)糖化的程度直接與血中葡萄糖濃度(以下稱(chēng)為血糖值)成比例，因此，例如，糖化血紅蛋白的情況下，通過(guò)測(cè)量糖化蛋白質(zhì)可以掌握約2 3個(gè)月內(nèi)的血糖控制狀態(tài)，糖化白蛋白的情況下，通過(guò)測(cè)量糖化蛋白質(zhì)可以掌握約 2 3周內(nèi)的血糖控制狀態(tài)。尤其是作為糖化血紅蛋白的一種的血紅蛋白Alc在糖尿病的診斷時(shí)被認(rèn)為是最重要的。作為上述糖化蛋白質(zhì)的測(cè)量方法，已知有高效液相色譜(HPLC)法、免疫法以及酶法等。在現(xiàn)有技術(shù)中，高效液相色譜(HPLC)法以及免疫法占據(jù)大部分，但是近年來(lái)由于酶法可以迅速、大量、正確且廉價(jià)地對(duì)大量樣本進(jìn)行測(cè)量，因此也開(kāi)始被頻繁采用。有關(guān)酶法，例如已知有通過(guò)以下的工序?qū)μ腔鞍踪|(zhì)進(jìn)行比色定量的技術(shù)(例如，參照專(zhuān)利文獻(xiàn)I 4)。(I)使待測(cè)試樣中的紅細(xì)胞溶血以提取出糖化血紅蛋白的工序。 (2)使上述糖化血紅蛋白與蛋白酶反應(yīng)從而從糖化血紅蛋白的糖化的β鏈N末端切出糖化氨基酸和/或糖化肽的工序。(3)使上述糖化氨基酸和/或糖化肽與糖化氨基酸氧化酶反應(yīng)從而生成過(guò)氧化氫的工序。(4)在過(guò)氧化物酶的存在下使上述過(guò)氧化氫與氧化還原類(lèi)顯色試劑反應(yīng)而顯色的工序。(5)根據(jù)上述顯色對(duì)待測(cè)試樣中的糖化血紅蛋白含量進(jìn)行比色定量的工序。但是，所涉及的現(xiàn)有技術(shù)是稀釋待測(cè)試樣、添加液體狀態(tài)的試劑、使之在反應(yīng)容器內(nèi)發(fā)生反應(yīng)后測(cè)量反應(yīng)液的吸光度的方法，以使用生物化學(xué)自動(dòng)分析裝置的方法為主流，但是所述生物化學(xué)自動(dòng)分析裝置存在是大型裝置且價(jià)格昂貴、需要熟練的檢測(cè)技師來(lái)操作、從採(cǎi)血到出報(bào)告結(jié)果為止的時(shí)間較長(zhǎng)這些問(wèn)題，難以適用于P0CT(point of care testing (即，臨床現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢查))。另一方面，為解決上述問(wèn)題，專(zhuān)利技術(shù)了糖化蛋白質(zhì)測(cè)量用試驗(yàn)片(例如專(zhuān)利文獻(xiàn)5)， 該試驗(yàn)片利用了所謂的干化學(xué)法，在該方法中，通過(guò)以干燥狀態(tài)將試劑承載在基材上，再向其添加液體狀態(tài)的待測(cè)試樣，從而將待測(cè)試樣中的水分作為溶劑而使反應(yīng)得以進(jìn)行。該專(zhuān)利技術(shù)改良點(diǎn)如下裝置為小型且廉價(jià)，操作簡(jiǎn)便，從採(cǎi)血到出報(bào)告結(jié)果為止可以短時(shí)間完成。 但是，存在得不到能夠經(jīng)得起實(shí)際使用的保存穩(wěn)定性的問(wèn)題，即糖化氨基酸氧化酶發(fā)生失活、分解、氧化還原類(lèi)顯色試劑發(fā)生自顯色的問(wèn)題。另外，從POCT的觀點(diǎn)出發(fā)，待測(cè)試樣的血液樣本必須進(jìn)行溶血等前處理這一點(diǎn)也存在問(wèn)題。另外，還公開(kāi)了利用了干化學(xué)法的由多層構(gòu)成的試劑試驗(yàn)片的專(zhuān)利技術(shù)(例如參照專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。該專(zhuān)利技術(shù)也具有如下改良點(diǎn)裝置為小型且廉價(jià)，操作簡(jiǎn)便，從採(cǎi)血到出報(bào)告結(jié)果為止可以短時(shí)間完成，但是，存在得不到能夠經(jīng)得起實(shí)際使用的保存穩(wěn)定性的問(wèn)題，即氧化還原類(lèi)顯色試劑發(fā)生自顯色的問(wèn)題。另外，如從將血液分離層配置在第一層也會(huì)獲知的那樣，該專(zhuān)利技術(shù)僅僅設(shè)想對(duì)糖化蛋白質(zhì)中的作為血漿蛋白質(zhì)的糖化白蛋白進(jìn)行測(cè)量，而沒(méi)有公開(kāi)任何有關(guān)測(cè)量糖化血紅蛋白的具體例子。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開(kāi)第2002-006519號(hào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2:特開(kāi)2004-222570號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3:特開(kāi)2007-181466號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)4:特開(kāi)2010-148515號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)5:特開(kāi)2004-333452號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)6:特開(kāi)2004-004071號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:Clinical Chemistry 43:122390-2396(1997)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
專(zhuān)利技術(shù)所要解決的技術(shù)問(wèn)題本專(zhuān)利技術(shù)是以有關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)問(wèn)題為背景進(jìn)行的。即，本專(zhuān)利技術(shù)的目的為提供一種用于在診斷現(xiàn)場(chǎng)正確、簡(jiǎn)便且迅速地對(duì)待測(cè)試樣中的糖化血紅蛋白含量進(jìn)行比色定量的多層試驗(yàn)片以及測(cè)量方法。更具體而言，本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種保存穩(wěn)定性?xún)?yōu)異的、用于對(duì)糖化血紅蛋白含量進(jìn)行比色定量的多層試驗(yàn)片以及測(cè)量方法。解決技術(shù)問(wèn)題的手段本申請(qǐng)專(zhuān)利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將蛋白酶與糖化氨基酸氧化酶承載在相同層時(shí)，在保存中發(fā)生由蛋白酶引起的糖化氨基酸氧化酶失活和/或分解，從而導(dǎo)致保存穩(wěn)定性顯著降低。另外還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將過(guò)氧化物酶與氧化還原類(lèi)顯色試劑承載在相同層時(shí)，在保存中發(fā)生由過(guò)氧化物酶引起的氧化還原類(lèi)顯色試劑的自顯色，從而導(dǎo)致保存穩(wěn)定性顯著降低。 由于與葡萄糖濃度等相比，待測(cè)試樣中的糖化血紅蛋白濃度一般為低濃度，因此在測(cè)量糖化血紅蛋白時(shí)優(yōu)選使用高靈敏度的無(wú)色色素，但無(wú)色色素特別不穩(wěn)定，容易發(fā)生自顯色。因而本申請(qǐng)專(zhuān)利技術(shù)人將蛋白酶與糖化氨基酸氧化酶承載在不同層上，并且將蛋白酶承載在比糖化氨基酸氧化酶更靠近待測(cè)試樣點(diǎn)樣面的層上。由此發(fā)現(xiàn)，糖化氨基酸氧化酶的保存穩(wěn)定性顯著提高，并且蛋白酶的反應(yīng)性也提高，測(cè)量精度也提高，從而完成了本專(zhuān)利技術(shù)。此外，通過(guò)將過(guò)氧化物酶與氧化還原類(lèi)顯色試劑分別承載在不同層上，使提高氧化還原類(lèi)顯色試劑的保存穩(wěn)定性同時(shí)獲得成功，從而完成了本專(zhuān)利技術(shù)。S卩，本專(zhuān)利技術(shù)具有以下構(gòu)成要素。1、一種多層試驗(yàn)片，用于對(duì)糖化血紅蛋白含量進(jìn)行比色定量，其特征在于該多層試驗(yàn)片至少層疊有下述(a)層和(b)層，所述(a)層和(b)層從待測(cè)試樣點(diǎn)樣面按(a)層、 (b)層的順序?qū)盈B，在(a)層和(b)層中的不同的層上分別承載過(guò)氧化物酶和氧化還原類(lèi)顯 色試劑，而且所述多層試驗(yàn)片不具有血液分離層，其中，(a)層至少承載有蛋白酶的高分 子基材，(b)層至少承載有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材。2、根據(jù)I所述的多層試驗(yàn)片，其特征在于所述多層試驗(yàn)片在(a)層和(b)中的至 少一層上還承載有表面活性劑。3、一種多層試驗(yàn)片，用于對(duì)糖化血紅蛋白含量進(jìn)行比色定量，其特征在于所述多 層試驗(yàn)片至少層疊有下述(a)層、(b)層和(C)層，所述(a)層、(b)層和(C)層從待測(cè)試樣 點(diǎn)樣面按(a)層、(b)層及(C)層、(a)層、(C)層及(b)層或(C)層、(a)層及(b)層的順 序?qū)盈B，在(a)層、(b)層和(C)層中的不同層上分別承載過(guò)氧化物酶和氧化還原類(lèi)顯色試 劑，而且所述多層試驗(yàn)片不具有血液分離層，其中，(a)層至少承載有蛋白酶的高分子基 材，(b)層至少承載有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材，(C)層至少承載有除蛋白酶和糖 化氨基酸氧化酶外的任意試劑的高分子基材。4、根據(jù)3所述的多層試驗(yàn)片，其特征在于所述多層試驗(yàn)片在(a)層、(b)層和(C) 層中的至少一層上還承載有表面活性劑。5、根據(jù)I至4中任一項(xiàng)所述的多層試驗(yàn)片，其特征在于蛋白酶是選自至少由 來(lái)自桿狀菌(Bacillus)的蛋白酶、來(lái)自曲霉菌(Aspergillus)的蛋白酶、來(lái)自鏈霉菌 (Streptomyces)的蛋白酶以及來(lái)自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶組成的組中的一種以上。6、根據(jù)I至5中任一項(xiàng)所述的多層試驗(yàn)片，其特征在于氧化還原類(lèi)顯色試劑是最 大吸收波長(zhǎng)為600nm 800nm的無(wú)色色素。7、根據(jù)I至6中任一項(xiàng)所述的多層試驗(yàn)片，其特征在于表面活性劑是親水親油平 衡值(Hydrophile Lipophile Balance Value HLB Value)為 10 20 的非離子性表面活本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種多層試驗(yàn)片，用于對(duì)糖化血紅蛋白含量進(jìn)行比色定量，其特征在于：所述多層試驗(yàn)片至少層疊有下述(a)層和(b)層，所述(a)層和(b)層從待測(cè)試樣點(diǎn)樣面按(a)層、(b)層的順序?qū)盈B，在(a)層和(b)層中的不同的層上分別承載過(guò)氧化物酶和氧化還原類(lèi)顯色試劑，而且所述多層試驗(yàn)片不具有血液分離層，其中，(a)層：至少承載有蛋白酶的高分子基材，(b)層：至少承載有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材。
【技術(shù)特征摘要】
...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：岡本淳，塚本曉，中森雅彥，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：東洋紡織株式會(huì)社，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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