糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法，它包括以下制備步驟：1）將血紅蛋白糖基化2）透析除去血紅蛋白溶液中葡萄糖防止血紅蛋白進(jìn)一步糖基化3）稀釋至所需質(zhì)控品濃度，冷凍干燥，最后將凍干粉復(fù)溶、分裝；按本發(fā)明專利技術(shù)制作出來的糖化血紅蛋白控品測(cè)值穩(wěn)定，能有效的監(jiān)控臨床檢驗(yàn)中試劑及儀器狀態(tài)；且相對(duì)于以往采用全血作為原料的方案，具有成本低、無污染、利于大批量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)
，具體講是一種。
技術(shù)介紹
糖尿病是危及人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病晚期帶來的并發(fā)癥(如腎病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病等)具有致死性，已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管病變之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病，被醫(yī)學(xué)界稱為沉默的殺手，嚴(yán)重威脅著人類健康。糖尿病治療關(guān)鍵是血糖水平的控制與穩(wěn)定，糖化血紅蛋白是血紅蛋白糖基化的產(chǎn)物，其能反映患者過去8 12周的平均血糖水平，且不受短期血糖濃度波動(dòng)的影響，已被糖尿病控制和臨床實(shí)驗(yàn)協(xié)會(huì)(DCCT)推薦為血糖控制測(cè)試“金標(biāo)準(zhǔn)”。糖化血紅蛋白的準(zhǔn)確測(cè)定需要一個(gè)穩(wěn)定質(zhì)控品來監(jiān)控儀器狀態(tài)及試劑的好壞。而由于糖化血紅蛋白存在易氧化及進(jìn)一步糖基化的缺陷，市場(chǎng)上現(xiàn)有的質(zhì)控品復(fù)溶后穩(wěn)定性差，人血用于作質(zhì)控品的原料來源有限且可能帶來HIV或者HPV等污染。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是，克服以上現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn):提供一種原料來源充足且穩(wěn)定性好的。本專利技術(shù)的技術(shù)解決方案如下: 一種，它包括以下制備步驟: O先在反應(yīng)液中加入血紅蛋白，使每分升反應(yīng)液中血紅蛋白含量為1-40克，在 15-45°C下糖基化反應(yīng)1-10天后，離心除去沉淀，留取上清夜，其中所述反應(yīng)液成分為: 緩沖液:20-200mM, pH 7.0-7.5 氯化鈉:9g/L 葡萄糖:50_200mM 還原劑:20-200mM 金屬螯合劑:0.1-1OmM 防腐劑質(zhì)量百分含量:0.1-5% 其中上述溶劑為水； 2)將步驟I)中制備的上清液裝入透析袋，置于4°C透析液中透析至完全除去葡萄糖，離心取上清液，其中所述透析液成分為:緩沖液:20-200mM, pH 7.0-7.5氯化鈉:9g/L還原劑:20-200mM金屬螯合劑:0.1-1OmM防腐劑質(zhì)量百分含量:0.1-5% 其中上述溶劑為水；3)將步驟2)中制備的上清液用血紅蛋白稀釋液稀釋至所需質(zhì)控品濃度，加入賦形劑，然后進(jìn)行低溫預(yù)凍、冷凍干燥，制成凍干粉，最后將凍干粉復(fù)溶、分裝即可使用；其中所述血紅蛋白稀釋液中的血紅蛋白濃度等于步驟I)中糖基化反應(yīng)前溶液中血紅蛋白濃度，且成分區(qū)別在于血紅蛋白稀釋液中不含葡萄糖。所述血紅蛋白為重組人血紅蛋白。所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、Good’ s緩沖液中的一種。所述還原劑為磷酸三(β-氯乙基)酯(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇、還原型谷胱甘肽、L-半胱氨酸、維生素C中的一種。所述金屬螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)中的一種。所述防腐劑為苯甲酸鈉、疊氮鈉、山梨酸鉀、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、proclin300 中的一種。所述賦形劑由凍干保護(hù)劑，填充劑，抗氧化劑，酸堿調(diào)整劑組成，其中各組分以它們加入溶液后的含量計(jì)為:凍干保護(hù)劑質(zhì)量百分含量0.5-10%，填充劑質(zhì)量百分含量0.5-15%，抗氧化劑摩爾濃度0.l-20mM,酸堿調(diào)整劑摩爾濃度0.05_20mM。所述凍干保護(hù)劑為甘油、二甲基亞砜(DMS0)、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一種；所述填充劑為甘露醇、山梨醇、PEG4000、明膠中的一種；所述抗氧化劑為維生素D、維生素E、硫代硫酸鈉中的一種；所述酸堿調(diào)整劑為乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、甘氨酸、谷氨酸鈉中的一種。 所述低溫預(yù)凍為在_50°C至_90°C的條件下，預(yù)凍3小時(shí)以上將溶液冷凍成型。所述冷凍干燥的條件為第一次干燥階段的升溫速度采用3-10°C每小時(shí)，持續(xù)20-35小時(shí)，第二次干燥階段的升溫速度采用20-25°C每小時(shí)，持續(xù)5_10h。本專利技術(shù)的有益效果是:按本專利技術(shù)制備的糖化血紅蛋白質(zhì)控品，測(cè)值穩(wěn)定，能有效的監(jiān)控臨床檢驗(yàn)中試劑及儀器狀態(tài)；且相對(duì)于以往采用全血作為原料的方案，具有成本低、無污染、利于大批量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施例方式下面用具體實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本專利技術(shù)不僅局限于以下具體實(shí)施例。實(shí)施例一 糖化血紅蛋白質(zhì)控品(5%)的制備: I)稱取重組人血紅蛋白2.6g，溶于20mL反應(yīng)液中，37°C反應(yīng)5天后，18000rpmX 30min離心去除沉淀，其中反應(yīng)液成分如下: 磷酸鉀緩沖液:50mM，pH 7.4 葡萄糖:100mM 氯化鈉:9g/LTCEP:50 mMEDTA:3mM疊氮鈉:1% 2)將步驟I)中制備的上清液裝入透析袋，置于4°C透析液中透析，其中所述透析液成分為: 磷酸鉀緩沖液:50mM，pH 7.4 氯化鈉:9g/LTCEP:50 mMEDTA:3mM 疊氮鈉:1% 透析時(shí)間24h，中間更換透析液4次，采用葡萄糖試劑測(cè)定葡萄糖含量，檢測(cè)不到葡萄糖含量時(shí)，透析結(jié)束，離心取上清液并測(cè)定其中糖化血紅蛋白在總血紅蛋白中的質(zhì)量百分含量，測(cè)得含量為20%，用130g/L的血紅蛋白溶液稀釋4倍得到5%質(zhì)控品，并準(zhǔn)確定值。3)往步驟2)中稀釋好的質(zhì)控品中加入海藻糖:1%，甘露醇:3%、聚維酮1%、甘氨酸:0.5mM,于-60°C低溫預(yù)凍5h，再放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，第一次冷凍干燥采用升溫速度5°C /h，持續(xù)28h，第·二次冷凍干燥采用25°C /h，持續(xù)5h后制得凍干粉。4)將步驟3)中所制凍干粉用水復(fù)溶后分裝，置于2°C環(huán)境中冷藏，每月測(cè)定一次糖化血紅蛋白含量，每次重復(fù)3次，取平均值，數(shù)據(jù)如下:本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法，其特征在于：它包括以下制備步驟：1）先在反應(yīng)液中加入血紅蛋白，使每分升反應(yīng)液中血紅蛋白含量為1?40克，在15?45℃下糖基化反應(yīng)1?10天后，離心除去沉淀，留取上清夜，其中所述反應(yīng)液成分為：緩沖液：20?200mM，pH?7.0?7.5氯化鈉：9g/L葡萄糖：50?200mM還原劑：20?200mM金屬螯合劑：0.1?10mM防腐劑質(zhì)量百分含量：0.1?5%其中上述溶劑為水；2）將步驟1）中制備的上清液裝入透析袋，置于4℃透析液中透析至完全除去葡萄糖，離心取上清液，其中所述透析液成分為：緩沖液：20?200mM，pH?7.0?7.5氯化鈉：9g/L還原劑：20?200mM金屬螯合劑：0.1?10mM防腐劑質(zhì)量百分含量：0.1?5%其中上述溶劑為水；3）將步驟2）中制備的上清液用血紅蛋白稀釋液稀釋至所需質(zhì)控品濃度，加入賦形劑，然后進(jìn)行低溫預(yù)凍、冷凍干燥，制成凍干粉，最后將凍干粉復(fù)溶、分裝即可使用。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法，其特征在于:它包括以下制備步驟: O先在反應(yīng)液中加入血紅蛋白，使每分升反應(yīng)液中血紅蛋白含量為1-40克，在 15-45°C下糖基化反應(yīng)1-10天后，離心除去沉淀，留取上清夜，其中所述反應(yīng)液成分為: 緩沖液:20-200mM, pH 7.0-7.5 氯化鈉:9g/L 葡萄糖:50_200mM 還原劑:20-200mM 金屬螯合劑:0.1-1OmM 防腐劑質(zhì)量百分含量:0.1-5% 其中上述溶劑為水； 2)將步驟I)中制備的上清液裝入透 析袋，置于4°C透析液中透析至完全除去葡萄糖，離心取上清液，其中所述透析液成分為:緩沖液:20-200mM, pH 7.0-7.5氯化鈉:9g/L還原劑:20-200mM金屬螯合劑:0.1-1OmM防腐劑質(zhì)量百分含量:0.1-5% 其中上述溶劑為水； 3)將步驟2)中制備的上清液用血紅蛋白稀釋液稀釋至所需質(zhì)控品濃度，加入賦形劑，然后進(jìn)行低溫預(yù)凍、冷凍干燥，制成凍干粉，最后將凍干粉復(fù)溶、分裝即可使用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法，其特征在于:所述血紅蛋白為重組人血紅蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法，其特征在于:所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、Good’ s緩沖液...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄒炳德，鄒繼華，賈江花，林丹，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：寧波美康生物科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：