一種檢測生物體內微囊藻毒素MC-LR的方法技術

本發明專利技術公開了一種檢測生物體內微囊藻毒素MC-LR的方法，包括微囊藻毒素MC-LR的提取、微囊藻毒素MC-LR的富集、分離與純化、UPLC-MS定性分析和外標法定量分析步驟。本發明專利技術方法能對生物體內的微囊藻毒素MC-LR進行定性、定量檢測，檢測結果可靠，重現性好，靈敏度高，應用該方法能檢測蝦類等生物體內是否存在累積的MC-LR；本發明專利技術方法不僅適用于生物體內微囊藻毒素MC-LR的定性及定量檢測，而且能為研究微囊藻毒素在生物體內的累積、傳遞和代謝解毒以及對水產品進行的安全性評估提供參考；該發明專利技術方法操作簡單，能節省檢測時間和化學試劑。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微囊藻毒素檢測
，具體地說，是一種檢測生物體內微囊藻毒素MC-LR的方法，尤其是涉及蝦體內累積的微囊藻毒素MC-LR的定性及定量檢測方法。
技術介紹
銅綠微囊藻水華是世界各國淡水、咸淡水湖泊、池塘中分布廣、規模大、持續時間長的一種產毒藍藻類水華，對多種生物都有強烈的毒害作用。銅綠微囊藻水華在我國尤為嚴重，2007年在我國太湖、滇池和巢湖爆發的水華，引發了極大的關注，造成了極大的負面影響，正是由這種藻類大量繁殖造成的。微囊藻的死亡分解不僅可以致使水體缺氧而發生惡臭，更為嚴重的是在藻細胞裂解的過程中能釋放出有強烈毒性的微囊藻毒素MC-LR，是水體中危害最嚴重的一類。在過去10年中，有大量的研究證實，自然水體中的微囊藻毒素MC-LR對鳥類、兩棲類、無脊椎動物和魚類甚至植物都有致死作用。銅綠微囊藻產生的微囊藻毒素MC-LR對人類健康也有潛在的影響。有研究結果表明，太湖地區飲用微囊藻污染的水源與小學生肝功能損害之間具有正相關關系。微囊藻毒素MC-LR已被確定為目前已知的最強的促癌劑之一。陳雋和謝平報道，在其所研究的兩種淡水食用蝦，秀麗白蝦和日本沼蝦樣品中，大約30%的蝦的肌肉組織中微囊藻毒素積累濃度超過了世界衛生組織推薦的限值，而肝胰腺中微囊藻毒素的含量幾乎全部超標。查廣才等的實驗結果顯示，銅綠微囊藻能在凡納濱對蝦的養殖水體中大量爆發，形成單一優勢種，種群增長快、持續時間長。其產生的銅綠微囊藻毒素的毒性表現為時間和密度雙重效應。然而，到目前為止，尚未見銅綠微囊藻對蝦類毒害機理以及毒素在體內的生物累積的系統報道；國內對微囊藻危害蝦類的嚴重性關注不夠，微囊藻毒素通過食物鏈進行傳遞并累積的情況鮮有報道。由于微囊藻毒素MC-LR在生物樣品中的濃度通常很低，干擾物質多，因而需要建立可靠、穩定的定量分析方法，并通過有效的富集、分離和純化過程實現高靈敏度、高專屬性分析，為進一步研究微囊藻毒素MC-LR在生物體內的代謝及解毒過程奠定基礎，為蝦類健康養殖和食品安全管理提供科學方法。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術中微囊藻毒素MC-LR檢測方法不完善的現狀，提供一種檢測生物體內微囊藻毒素MC-LR的方法，能可靠、穩定地對生物體內微囊藻毒素MC-LR進行定性定量分析。為實現上述目的，本專利技術采取的技術方案是: 一種檢測生物體內微囊藻毒素MC-LR的方法，包括以下步驟: (I)微囊藻毒素MC-LR的提取:稱取冷凍干燥的生物組織樣品于研缽中研碎，向研碎后生物組織樣品中加入提取液，勻漿，超聲破碎，離心，移取上清液至干凈容器中避光保存，再加入提取液清洗沉淀，離心后收集上清液，合并所得上清液；所述提取液為EDTA-Na2的甲酸水溶液，EDTA-Na2的濃度為0.0l 0.05mol/L,甲酸的體積百分比濃度為1% 5% ； (2)微囊藻毒素MC-LR的富集、分離與純化:將步驟(I)中所得的上清液加入已預先活化的HLB固相萃取柱進行富集，先用超純水淋洗，再用體積百分比濃度為10%的甲醇水溶液淋洗，最后用無水甲醇洗脫，收集洗脫液用氮氣吹干，所得固體用甲酸-甲醇-水溶液溶解制成樣品待測液，所述甲酸-甲醇-水溶液中，甲酸的體積百分比濃度為1%，甲醇的體積百分比濃度為20% ； (3)定性分析:采用UPLC-MS聯用方法，根據微囊藻毒素MC-LR標準品的保留時間和特征碎片離子峰的荷質比m/z進行定性； 色譜條件:流動相A為含體積百分比濃度為0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含體積百分比濃度為0.1%甲酸的甲醇溶液；色譜柱=C18柱，IOOmmX 2.lmm, 1.8ym ;柱溫:40°C;進樣體積為10 μ L ;流速為0.35mL/min ；UPLC梯度洗脫程序見表1: 表I UPLC梯度洗脫程序權利要求1.一種檢測生物體內微囊藻毒素MC-LR的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)微囊藻毒素MC-LR的提取:稱取冷凍干燥的生物組織樣品于研缽中研碎，向研碎后生物組織樣品中加入提取液，勻漿，超聲破碎，離心，移取上清液至干凈容器中避光保存，再加入提取液清洗沉淀，離心后收集上清液，合并所得上清液；所述提取液為EDTA-Na2的甲酸水溶液，EDTA-Na2的濃度為0.0l 0.05mol/L,甲酸的體積百分比濃度為1% 5% ； (2)微囊藻毒素MC-LR的富集、分離與純化:將步驟(I)中所得的上清液加入已預先活化的HLB固相萃取柱進行富集，先用超純水淋洗，再用體積百分比濃度為10%的甲醇水溶液淋洗，最后用無水甲醇洗脫，收集洗脫液用氮氣吹干，所得固體用甲酸-甲醇-水溶液溶解制成樣品待測液，所述甲酸-甲醇-水溶液中，甲酸的體積百分比濃度為1%，甲醇的體積百分比濃度為20% ； (3)定性分析:采用UPLC-MS聯用方法，根據微囊藻毒素MC-LR標準品的保留時間和特征碎片離子峰的荷質比m/z進行定性； 色譜條件:流動相A為含體積百分比濃度為0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含體積百分比濃度為0.1%甲酸的甲醇溶液；色譜柱=C18柱，IOOmmX 2.lmm, 1.8ym ;柱溫:40°C;進樣體積為10 μ L ;流速為0.35mL/min ；UPLC梯度洗脫程序見下表:2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物體為蝦或大型潘。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的離心條件為3000 8000r/min，超聲破碎時間3 5min，超聲破碎溫度O 4°C。全文摘要本專利技術公開了一種檢測生物體內微囊藻毒素MC-LR的方法，包括微囊藻毒素MC-LR的提取、微囊藻毒素MC-LR的富集、分離與純化、UPLC-MS定性分析和外標法定量分析步驟。本專利技術方法能對生物體內的微囊藻毒素MC-LR進行定性、定量檢測，檢測結果可靠，重現性好，靈敏度高，應用該方法能檢測蝦類等生物體內是否存在累積的MC-LR；本專利技術方法不僅適用于生物體內微囊藻毒素MC-LR的定性及定量檢測，而且能為研究微囊藻毒素在生物體內的累積、傳遞和代謝解毒以及對水產品進行的安全性評估提供參考；該專利技術方法操作簡單，能節省檢測時間和化學試劑。文檔編號G01N30/06GK103197021SQ20131012005公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月9日 優先權日2013年4月9日專利技術者劉利平, 蘇曉明, 陳桃英 申請人:上海海洋大學本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測生物體內微囊藻毒素MC?LR的方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）微囊藻毒素MC?LR的提取：稱取冷凍干燥的生物組織樣品于研缽中研碎，向研碎后生物組織樣品中加入提取液，勻漿，超聲破碎，離心，移取上清液至干凈容器中避光保存，再加入提取液清洗沉淀，離心后收集上清液，合并所得上清液；所述提取液為EDTA?Na2的甲酸水溶液，EDTA?Na2的濃度為0.01～0.05mol/L，甲酸的體積百分比濃度為1%～5%；（2）微囊藻毒素MC?LR的富集、分離與純化：將步驟（1）中所得的上清液加入已預先活化的HLB固相萃取柱進行富集，先用超純水淋洗，再用體積百分比濃度為10%的甲醇水溶液淋洗，最后用無水甲醇洗脫，收集洗脫液用氮氣吹干，所得固體用甲酸?甲醇?水溶液溶解制成樣品待測液，所述甲酸?甲醇?水溶液中，甲酸的體積百分比濃度為1%，甲醇的體積百分比濃度為20%；（3）定性分析：采用UPLC?MS聯用方法，根據微囊藻毒素MC?LR標準品的保留時間和特征碎片離子峰的荷質比m/z?進行定性；色譜條件：流動相A為含體積百分比濃度為0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含體積百分比濃度為0.1%甲酸的甲醇溶液；色譜柱：C18柱，100mm×2.1mm，1.8μm；柱溫：40℃；進樣體積為10μL；流速為0.35mL/min；UPLC梯度洗脫程序見下表：質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式掃描，多反應監測（MRM）方式檢測；毛細管電壓為3.5kV；霧化溫度為450℃；霧化作用和噴霧作用均使用氮氣，氮氣流速分別為850?L/h和50?L/h；質譜分析的條件參數見下表：（4）定量分析：使用外標法，用色譜峰面積定量，用體積百分比濃度為20%的甲醇水溶液配制微囊藻毒素MC?LR標樣系列，微囊藻毒素MC?LR濃度范圍為0～250ng/mL，在與樣品待測液相同的色譜條件下直接進樣，以微囊藻毒素MC?LR的濃度為橫坐標，相應的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，由其回歸方程對樣品待測液進行定量。988776dest_path_image001.jpg,982140dest_path_image002.jpg...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉利平，蘇曉明，陳桃英，
申請(專利權)人：上海海洋大學，
類型：發明
國別省市：