一種基于殼核型上轉換材料和二硫化鉬發生熒光共振能量轉移檢測微囊藻毒素LR的方法，用于實際水樣中微囊藻毒素LR(MC?LR)的檢測。制備殼核型上轉換納米材料(NaYF4:Yb,Tm@NaYF4:Yb)提高其熒光強度。將上轉換材料與MC?LR的核酸適配體連接后，核酸堿基與二硫化鉬基底面通過范德華力吸附，上轉換材料與二硫化鉬間發生熒光共振能量轉移現象，熒光淬滅。當檢測中存在MC?LR時，MC?LR與其適配體特異性結合，適配體構象改變，從二硫化鉬基底面分離，熒光恢復。監測361nm處的熒光強度，能定量檢測MC?LR，線性范圍為0.01?50ng/ml，檢出限為0.002ng/ml。本發明專利技術用于MC?LR檢測靈敏度高，特異性強，穩定性好。并用于自來水及太湖水的檢測，結果準確可靠。
【技術實現步驟摘要】
一種基于殼核型上轉換材料和二硫化鉬發生熒光共振能量轉移檢測微囊藻毒素LR的方法，涉及納米材料和分析化學
，用于對水中微囊藻毒素LR的檢測。
技術介紹
微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是由淡水藍綠藻產生的一類毒性強、急性危害大的環七肽縮氨酸肝毒素，對水生生物、人類飲用水安全和人類健康產生嚴重影響。其中，微囊藻毒素-(亮氨酸-精氨酸)(Microcystin-(leucine-arginine)，MC-LR)是最常見、急性毒性最大的微囊藻毒素之一。其具有較強的肝毒性,并對心、腎、脾臟及胃腸也具有一定的毒性。目前，檢測水體中MC-LR的傳統方法中，高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用技術檢測效果較好，但其儀器設備價值昂貴、操作繁瑣且對操作人員技術要求較高；植物細胞的生物測試法和蛋白磷酸酶抑制法靈敏度相對較低；酶聯免疫吸附法靈敏度較高，但其線性范圍較窄。所以，開發一種靈敏度高、特異性強，穩定性好，快速方便的新型檢測方法很有必要。核酸適配體(Aptamer)是通過指數富集系統配體進化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)篩選獲得的，與靶標具有高親和力和特異性結合的核糖核酸(RNA)或單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)。這種寡核苷酸序列形成的高級結構能夠識別與之對應的小分子、蛋白質、細胞、微生物等多種靶標。與抗體相比，適配體的靶分子范圍廣，體外篩選，易人工合成和修飾，分子小，對溫度不敏感，穩定性好，容易保存。經過二十多年的發展，適配體已成為一種新型識別元件在醫療診斷與臨床治療、分析檢測、分離純化和食品安全等領域發揮廣泛作用。上轉換發光納米材料(UpconversionNanoparticles)是一類吸收長波長、低能量光子，發射短波長高能量光子的新型熒光探針材料，具有許多獨特的優點，檢測背景低，穿透性強，光化學穩定，可以選擇不同的基質材料和摻雜離子來調節上轉換發光，并且可以實現同一激發，不同發射。鑒于上述優點，上轉換發光納米材料已成為一種優秀的生物標記材料。而殼核型上轉換材料更是克服了由于材料表面缺陷和表面配體而導致熒光淬滅，大大提高了熒光強度。二硫化鉬(MolybdenumDisulfide)作為一種新型的二維層狀納米材料，近年來以其獨特的物理、化學性質而成為新興的研究熱點。層狀的二硫化鉬材料被廣泛地應用于光催化劑、電化學生物傳感器、鋰離子電池的電極材料、超級電容器及光學器件等方面的應用。本專利技術首先制備殼核型上轉換納米材料(NaYF4:Yb,Tm@NaYF4:Yb)提高其熒光強度。同時二硫化鉬材料具有良好的熒光淬滅能力，并且對單鏈DNA有較強的吸附能力，可以作為熒光受體。將上轉換材料與微囊藻毒素LR的核酸適配體連接后，核酸堿基與二硫化鉬基底面通過范德華力吸附，使得上轉換納米材料與二硫化鉬之間的距離拉近，發生熒光共振能量轉移現象，從而實現熒光淬滅。當檢測中存在微囊藻毒素LR時，微囊藻毒素LR與核酸適配體特異性結合，適配體空間構象發生改變，從而與二硫化鉬基底面分離，熒光恢復。監測361nm處的熒光恢復值，在一定范圍內，微囊藻毒素LR對數濃度與上轉換熒光信號恢復值成正比，建立標準曲線，達到對微囊藻毒素LR檢測的目的。
技術實現思路
一種基于殼核型上轉換發光材料和二硫化鉬發生熒光共振能量轉移檢測微囊藻毒素LR的方法：制備了殼核型上轉換發光納米材料NaYF4:Yb,Tm@NaYF4:Yb，對其進行表面改性并與親和素(Avidin)偶聯，上轉換發光納米材料通過親和素(Avidin)與生物素(Biotin)修飾的適配體DNA特異性結合。以其為能量供體，與能量受體二硫化鉬經過一段時間孵育，核酸堿基與二硫化鉬基底面通過范德華力吸附，使得上轉換納米材料與二硫化鉬之間的距離拉近，發生熒光共振能量轉移現象，從而實現淬滅熒光。利用980nm激光激發，此時的熒光信號為最小值。當檢測中存在微囊藻毒素LR時，微囊藻毒素LR與核酸適配體特異性結合，適配體空間構象發生改變，從而與二硫化鉬基底面分離，熒光信號增強。監測361nm處的熒光恢復值，在一定范圍內，微囊藻毒素LR對數濃度與上轉換熒光信號恢復值成正比，建立標準曲線，達到對微囊藻毒素LR檢測的目的。步驟為：(1)通過高溫熱解法技術，制備NaYF4:Yb,Tm上轉換發光顆粒。稱取一定量的YCl3·6H2O，YbCl3·6H2O，TmCl3·6H2O(Ln:79.5mol％Y3+，20mol％Yb3+，0.5mol％Tm3+，共計1mmol)于100ml三口燒瓶中，加入4mL油酸以及16mL1-十八烯。磁力攪拌條件下，逐漸升高溫度至160℃保持半小時，自然冷卻至室溫。準確稱取0.1g氫氧化鈉和0.148g氟化銨，溶于10mL甲醇溶液混合均勻。將上述溶液緩慢加入到三口燒瓶中，升至50℃磁力攪拌30min。之后溫度升至80℃保持30min緩慢蒸發甲醇，脫氣后，將混合液加熱到300℃，持續1h。反應結束后，自然冷卻到室溫，用環己烷和乙醇洗滌三次，分散在5ml環乙烷中備用。(2)通過高溫熱解法技術，制備NaYF4:Yb,Tm@NaYF4:Yb上轉換發光顆粒。稱取一定量的YCl3·6H2O，YbCl3·6H2O(Ln:80mol％Y3+，20mol％Yb3+，共計1mmol)于100ml三口燒瓶中，加入4mL油酸以及16mL1-十八烯。磁力攪拌條件下，逐漸升高溫度至160℃保持半小時，自然冷卻至室溫。將上述環己烷分散的NaYF4:Yb,Tm納米材料滴加入三口燒瓶中，之后加入10ml甲醇分散的0.1g氫氧化鈉和0.148g氟化銨，溫度升至50℃磁力攪拌30min。之后溫度升至80℃保持45min緩慢蒸發甲醇和環乙烷，脫氣后，將混合液加熱到300℃，持續1h。反應結束后，自然冷卻到室溫，用環己烷和乙醇洗滌三次，干燥以待進一步表征。(3)利用配體交換法對上轉換發光納米顆粒進行表面羧基化修飾。取30mg油酸包覆的NaYF4:Yb,Tm@NaYF4:Yb上轉換納米材料，分散在5ml氯仿和甲苯混合溶液中，體積比為2:3。再將其加入到10ml溶解有200mg聚丙烯酸的水溶液中，攪拌24h。通過離心獲得聚丙烯酸納米材料，水清洗三次。(4)利用EDC/NHS法將羧基化上轉換發光納米材料與親和素(Avidin)偶聯。稱取2mg聚丙烯酸修飾的上轉換納米材料分散于2mLPBS(pH7.4)緩沖液中，超聲15min，加入0.16mL2mg/mLEDC溶液和0.08mL2mg/mLNHS溶液，37℃搖床中活化2h。離心收集材料，用PBS沖液清洗三次，然后分散于1.8mlPBS中，加入200μL1mg/mL親和素溶液，在37℃搖床中反應2h。反應結束后清洗數次，棄上清。(5)通過親和素(Avidin)與生物素(Biotin)之間的特異性結合將表面修飾親和素(Avidin)的上轉換發光納米顆粒與生物素(Biotin)修飾的微囊藻毒素LR適配體DNA單鏈連接。具體方法為：將親和素修飾的上轉換納米材料分散于2mLPBS緩沖液中，加入一定量的生物素化微囊藻毒素LR適配體，在37℃搖床中孵育12h，離心收集材料和上清，用磷酸緩沖液本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于殼核型上轉換材料和二硫化鉬發生熒光共振能量轉移檢測微囊藻毒素LR的方法，其特征在于：制備殼核型上轉換納米材料(NaYF4:Yb,Tm@NaYF4:Yb)提高其熒光強度。將上轉換材料與微囊藻毒素LR的核酸適配體連接后，核酸堿基與二硫化鉬基底面通過范德華力吸附，使得上轉換納米材料與二硫化鉬之間的距離拉近，發生熒光共振能量轉移現象，從而實現熒光淬滅。當檢測中存在微囊藻毒素LR時，微囊藻毒素LR與核酸適配體特異性結合，適配體空間構象發生改變，從而與二硫化鉬基底面分離，熒光恢復。監測361nm處的熒光恢復值，在一定范圍內，微囊藻毒素LR對數濃度與上轉換熒光信號恢復值成正比，建立標準曲線，達到對微囊藻毒素LR檢測的目的。
【技術特征摘要】
1.一種基于殼核型上轉換材料和二硫化鉬發生熒光共振能量轉移檢測微囊藻毒素LR的方法，其特征在于：制備殼核型上轉換納米材料(NaYF4:Yb,Tm@NaYF4:Yb)提高其熒光強度。將上轉換材料與微囊藻毒素LR的核酸適配體連接后，核酸堿基與二硫化鉬基底面通過范德華力吸附，使得上轉換納米材料與二硫化鉬之間的距離拉近，發生熒光共振能量轉移現象，從而實現熒光淬滅。當檢測中存在微囊藻毒素LR時，微囊藻毒素LR與核酸適配體特異性結合，適配體空間構象發生改變，從而與二硫化鉬基底面分離，熒光恢復。監測361nm處的熒光恢復值，在一定范圍內，微囊藻毒素LR對數濃度與上轉換熒光信號恢復值成正比，建立標準曲線，達到對微囊藻毒素LR檢測的目的。2.如權利要1所述的一種基于殼核型上轉換材料和二硫化鉬發生熒光共振能量轉移檢測微囊藻毒素LR的方法，其特征在于：合成NaYF4:Yb,Tm@NaYF4:Yb殼核型上轉換納米顆粒，結合平均厚度為0.8nm的單層二硫化鉬用...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王周平，呂佳佳，吳世嘉，段諾，夏雨，馬小媛，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。