新型陽離子脂質體核酸類藥物制劑，及其制備方法和應用技術

本發明專利技術公開了一種新型陽離子脂質體、包含其的陽離子脂質體核酸類藥物制劑，及其制備方法和用途。所述陽離子脂質體包含陽離子脂質、輔助脂、聚羧基甜菜堿脂質分子和冷凍保護劑。所述陽離子脂質體核酸類藥物制劑包含用聚羧基甜菜堿中性脂質修飾的陽離子脂質體和核酸類藥物制劑工作液。本發明專利技術涉及的陽離子脂質體克服了陽離子脂質體毒性高、血液穩定性差和轉染效率低的缺點，有效地提高了核酸類藥物的藥效，同時由于該制劑使用時不受血清干擾，因此簡化了實驗和治療中操作。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及陽離子脂質體，更具體地涉及一種含有聚羧基甜菜堿中性脂質的陽離子脂質體，包含其的核酸類藥物制劑及它們的制備方法和應用。
技術介紹
基因轉染是將具有生物功能的核酸轉運至細胞內，并使核酸在細胞內維持其生物功能。由于裸露的核酸分子在組織或細胞中易被核酶降解，且核酸分子自身帶有負電荷，不利于細胞膜作用，細胞滲透能力差。因此，研究人員積極開發了多種基因載體，并且在其選擇性、安全性和高效性上不斷進行研究和改進。目前，研究和臨床應用中常用的載體大致分為病毒載體和非病毒載體兩類。病毒載體因其高效而倍受關注，但其負載量低、特異性不強、安全性差和無法實現大規模生產等缺點，給實際應用帶來很大障礙。非病毒載體主要包括陽離子聚合物和陽離子脂質體。陽離子聚合物基因載體相對于病毒載體具有一定優勢，然而其基因轉染效率低，所用聚合物材料多為非生物可降解材料，尤其是反復給藥后這些材料容易積聚于體內，可能會引發毒性反應。陽離子脂質體通常由陽離子脂質和輔助脂在適當的條件下復合而成，其中陽離子脂質通過靜電作用與基因復合，而輔助脂則起到防止脂質氧化或將配體連接至脂質體的表面的作用或者可以減少脂質顆粒的聚集。與陽離子聚合物相比，陽離子脂質體具有低毒、生物相容性好及轉染效率高等優點，是一種應用較為廣泛的非病毒基因載體。雖然陽離子脂質體是一種具有發展前景的非病毒載體，然而其在體內應用中仍然存在困難。主要是陽離子脂質體基因復合物由于表面帶有正電荷，易于與帶有負電荷的血清蛋白發生非特異性吸附，形成大尺寸的聚合物，該聚合物易被單核吞噬系統清除，從而導致陽離子脂質體基因復合物在血液中的循環能力變差，轉染效率降低。為此，需要對陽離子脂質體進行表面修飾，制備長循環陽離子脂質體。目前常用的長循環陽離子脂質體修飾試劑為基于聚乙二醇(PEG)的脂質分子，如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)分子。PEG通過氫鍵和溶劑中的 水分子作用，在被修飾的陽離子脂質體表面形成一層水合層，掩蓋陽離子脂質體表面正電荷，從而達到抑制蛋白質吸附并減少吞噬系統識別的作用。然而，應用中發現，基于DSPE-PEG修飾的陽離子脂質體基因轉染試劑盡管細胞毒性低、血清穩定性好，操作簡單，但仍存在以下缺點=(I)PEG修飾影響陽離子脂質體對于基因的復合能力，導致陽離子脂質體對基因復合能力不好，包埋率降低；(2) PEG修飾影響陽離子脂質體基因轉染試劑的內涵體逃逸過程，導致基因無法有效釋放進入細胞質，降低基因轉染效率。另一種常用的陽離子脂質體Lipofectamine 2000 (Invitrogen)具有良好的基因復合能力和內涵體逃逸能力，但是其細胞毒性大(存活率〈50%)，在血清中穩定性不好，因此轉染效率也較低，并且其在轉染過程中需要更換培養基，操作也比較復雜。因此本領域中需要生物毒性小，在血清中穩定，轉染效率更高并且操作簡單的陽離子脂質體以及相應的核酸類藥物制劑。
技術實現思路
為了解決現有技術中存在的上述問題，本專利技術的專利技術人進行了大量、細致的研究工作，結果發現，聚羧基甜菜堿中性脂質的每個單體單元側鏈都有一個陰離子基團(羧酸根基團)和一個陽離子基團(季胺基團)并且總體表現中性，可利用陽離子和陰離子基團與水分子的靜電相互作用吸附大量水分子，在被修飾陽離子脂質體表面形成水合層，有效抵抗非特異性蛋白質與陽離子脂質體的吸附作用，增強陽離子脂質體的血液穩定性，延長陽離子脂質體的血液循環時間，提高陽離子脂質體的基因轉染和治療效率，從而完成了本專利技術。因此，本專利技術的目的在于提供一種具有優異抗非特異性蛋白吸附性能的用聚羧基甜菜堿(PCB)中性脂質分子修飾的陽離子脂質體核酸類藥物制劑，及其制備方法和應用。為達此目的，本專利技術采用以下技術方案:在第一方面，本專利技術提供了一種陽離子脂質體，其特征在于，所述陽離子脂質體包含陽離子脂質、輔助脂和聚羧基甜菜堿中性脂質，優選地，還包含冷凍保護劑；其中，陽離子脂質可以為本領域中熟知的可用于制備陽離子脂質體的各種陽離子脂質，優選地，所述陽離子脂質為(2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化銨(D0TAP)、雙十八烷基二甲基溴化銨(DDAB)、N--N，N, N-氯化三甲胺(DOTMA)和/或精胺-5-羧基-氨基乙酸二十八烷基-酰胺(DOGS)，雙油基雙甲基氯化銨、N-(N’，N’ - 二甲基胺乙基)胺基丙酰基-膽固醇(DC-Chol)、N，N-二甲基-N-羥乙基-N- (1，2_雙十四烷氧基)丙基溴化銨、1，2-二亞油氧基-N，N-二甲基丙胺、1，2-二亞麻氧基-N，N-二甲基丙胺、二硬脂基二甲基銨鹽，更優選為DOTAP、DDAB, DC-Chol和/或DOTMA ；輔助脂可以為本領域中熟知的可用于制備陽離子脂質體的各種輔助脂，優選地，所述輔助脂為1，2-油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和/或膽固醇，更優選為DOPE;聚羧基甜菜堿中性脂質是兩性離子聚羧基甜菜堿脂質，其每個單體單元側鏈都有一個陰離子基團(羧酸根基團)和一個陽離子基團(季胺基團)并且總體表現中性，優選地，所述聚羧基甜菜堿中性脂質為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚羧基甜菜堿(DSPE-PCBn)、1，2-油?；字Ｒ掖及?聚羧基甜菜堿(D0PE-PCBn)、1，2-十八?；?sn_甘油-聚羧基甜菜堿(DG_PCBn)、膽固醇-聚羧基甜菜堿(膽固醇-PCBn)和/或α -十六烷基丙三醇醚-聚羧基甜菜堿(HG-PCBn),更優選為DSPE-PCBn、DOPE-PCBn和/或膽固醇-PCBn ;其中，所述聚羧基甜菜堿(PCBn)中聚合度η為I 500間任意整數，優選為I 100間任意整數，進一步優選為5 50間任意整數,最優選為10 30間任意整數；優選地，冷凍保護劑為水溶性高分子物質，更優選為單糖、二糖、寡聚糖、多糖和/或多元醇，進一步優選為二糖，還進一步優選為海藻糖、麥芽糖、蔗糖及乳糖。本專利技術中的陽離子脂質體的特征在于，陽離子脂質:輔助脂:聚羧基甜菜堿中性脂質(摩爾比)=n:1:m，其中η可以為0.1 100，優選可以為0.2 50，更優選可以為0.5 10;m可以為0.1 100，優選可以為0.2 10，更優選可以為0.4 I。在第二方面，本專利技術提供了如第一方面所述的陽離 子脂質體的制備方法，其特征在于，采用下述方法來制備所述陽離子脂質體:所述方法為薄膜分散法、超聲分散法、反相蒸發法、冷凍干燥法、凍融法、復乳法和/或注入法，優選為薄膜分散法、超聲分散法和/或反相蒸發法。本專利技術的陽離子脂質體的制備方法中，所述薄膜分散法可以包括以下步驟:(I)稱取陽離子脂質、輔助脂和聚羧基甜菜堿中性脂質，將其在有機溶劑中充分溶解，搖勻，減壓旋蒸除去有機溶劑，形成油膜，用真空泵抽干，徹底除去有機溶劑；(2)加入溶解有冷凍保護劑的磷酸鹽緩沖液，水浴超聲，形成半透明狀乳液；(3)將乳液加入到高壓均質機中過壓，之后將過壓后的乳液加入脂質體擠出器中過膜，形成陽離子脂質體；和(4)任選地，將所述陽離子脂質體在冷凍干燥機中干燥，形成陽離子脂質體粉末；其中，優選地，所述有機溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷和/或甲醇，更優選為三氯甲烷和甲醇；優選地,所述減壓旋蒸的轉速為30 300rpm,更優選為50 200rpm,最優本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種陽離子脂質體，其特征在于，所述陽離子脂質體包含陽離子脂質、輔助脂和聚羧基甜菜堿中性脂質，任選地，所述陽離子脂質體還包含冷凍保護劑；?其中，優選地，所述陽離子脂質為（2,3?二油氧基丙基）三甲基氯化銨（DOTAP）、雙十八烷基二甲基溴化銨（DDAB）、N?[1?（2,3?二油酰氯）丙基]?N,N,N?氯化三甲胺（DOTMA）和/或精胺?5?羧基?氨基乙酸二十八烷基?酰胺（DOGS），雙油基雙甲基氯化銨、N?(N’，N’?二甲基胺乙基)胺基丙?；?膽固醇（DC?Chol）、N，N?二甲基?N?羥乙基?N?（1,2?雙十四烷氧基）丙基溴化銨、1,2?二亞油氧基?N，N?二甲基丙胺、1,2?二亞麻氧基?N，N?二甲基丙胺、二硬脂基二甲基銨鹽，更優選為DOTAP、DDAB、DC?Chol和/或DOTMA；?優選地，所述輔助脂為1,2?油?；字Ｒ掖及罚―OPE）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）和/或膽固醇，更優選為DOPE；?優選地，所述聚羧基甜菜堿中性脂質為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺?聚羧基甜菜堿（DSPE?PCBn）、1,2?油?；字Ｒ掖及?聚羧基甜菜堿（DOPE?PCBn）、1,2?十八?；?sn?甘油?聚羧基甜菜堿（DG?PCBn）、膽固醇?聚羧基甜菜堿（膽固醇?PCBn）和/或α?十六烷基丙三醇醚?聚羧基甜菜堿（HG?PCBn），更優選為DSPE?PCBn、DOPE?PCBn和/或膽固醇?PCBn；其中，所述聚羧基甜菜堿（PCBn）中聚合度n為1～500間任意整數，優選為1～100間任意整數，進一步優選為5～50間任意整數，最優選為10～30間任意整數；?優選地，冷凍保護劑為水溶性高分子物質，更優選為單糖、二糖、寡聚糖、多糖和/或多元醇，進一步優選為二糖，還進一步優選為海藻糖、麥芽糖、蔗糖和/或乳糖。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張欣，梁子才，梁興杰，代鳳英，李燕，程強，
申請(專利權)人：中國科學院過程工程研究所，北京大學，國家納米科學中心，
類型：發明
國別省市：