本發明專利技術涉及具有抗植物病原菌作用的銀杏內生真菌抗菌發酵液的制備方法，所述銀杏內生真菌命名為腐皮鐮孢T-7，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為CGMCC?No.5089。所述抗菌發酵液的具體制備操作步驟如下：（1）菌種活化，（2）一級、二級種子培養，（3）發酵培養，所得發酵液為橙紅色。抗菌試驗發現：本發明專利技術的銀杏內生真菌T-7的抗菌發酵液對供試的5種植物病原真菌（番茄枯萎病菌，蘋果腐爛病菌，蘋果炭疽病菌，梨黑星病菌，小麥赤霉病菌）的菌絲生長具有較為明顯的抑制作用。本發明專利技術以植物內生真菌作為資源，以求獲得抗植物病原真菌病害的新型農用抗生素類天然活性物。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物
，涉及一種發酵培養方法，具體涉及銀杏內生真菌的抗菌發酵液的制備方法。
技術介紹
農業生產過程中，大量使用化學農藥引起一系列環境和健康問題已被人廣泛認知，研制安全、高效、環保的新型農藥已成為發展的方向和研究的主題。微生物農藥因對環境友好，不易產生抗性，生產成本低，發酵工藝簡單，對非靶標生物安全等優點，成為新型農藥發展的熱點和重點。作為重要的藥源之一的植物內生真菌(Endophytic fungi)，在與宿主植物長期相互作用、協同進化的·過程中，在植物體內維持了微生態系統平衡。為了保持這種平衡，植物內生真菌可能產生與宿主植物相同或相似功能的次生代謝產物。因此,可將植物內生真菌的次生代謝產物作為新化合物、新藥物篩選的潛在或替代資源，從而有效降低新藥物或其它用途活性物質的研發成本。銀杏{Ginkgo biloba L.)素有裸子植物“活化石”和“植物界熊貓”之稱，是中國特有的珍貴樹種，在漫長的生長期中幾乎不感染病蟲害，壽命極長。根據植物內生真菌內共生理論推斷，銀杏中很有可能存在著某些內生真菌，通過產生具有特殊抗菌活性的次生代謝產物，影響宿主銀杏的抗病害能力。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種對植物病原真菌的菌絲生長具有較好抑制作用的銀杏內生真菌抗菌發酵液的制備方法。本專利技術所述的銀杏內生真菌命名為腐皮鐮孢T-7 Q7UsariUm solani T-7),現保藏在國家知識產權局指定的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為CGMCC N0.5089。本專利技術的銀杏內生真菌系從中國安徽省合肥市銀杏biloba L)植物活體中分離得到。抗菌發酵液的具體制備方法如下: 所述抗菌發酵液的具體制備操作步驟如下: (1)菌種活化 在無菌條件下，用接種環挑取少許保藏的銀杏內生真菌的菌種，轉接于已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板中，恒溫避光培養5天，培養溫度28°C 土 TC，得到活化菌種； (2)種子培養 無菌條件下，利用接種環挑取3環活化菌種，接種于50ml的馬鈴薯葡萄糖液體培養基內，恒溫搖床培養2天，搖床轉速160轉/分，溫度28°C ±1°C，得到一級種子；將一級種子，以10%接種量，接種于50ml的液體培養基中，恒溫搖床培養2天，搖床轉速160轉/分，溫度28°C ± I°C，得到二級種子； (3)發酵培養 將二級種子接種到50ml的液體培養基中，接種量10%，恒溫搖床培養7天，搖床轉速160轉/分，溫度28°C ±1°C，得到銀杏內生真菌發酵液；發酵液過濾除去菌絲體，無菌條件下，過0.22微米過濾器，即得到銀杏內生真菌T-7的抗菌發酵液。發酵培養特征:培養第I天，菌體為少量淡粉色的粉末；培養第3天，淡粉色的細粉末減少，出現粉色的小菌絲球；培養第5天，粉紅色菌絲球繼續增多，體積變大，發酵液為橙紅色；培養第7天，出現大量紅色的菌絲球，體積變大，發酵液為橙紅色。所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水I升。所述馬鈴薯葡萄糖液體培養基的制備:馬鈴薯200克，葡萄糖20克、蒸餾水I升，pH自然。所述液體培養基:蛋白胨15克，葡萄糖20克，硝酸鈉I克，氯化鈣0.5克，硫酸鎂0.1克，磷酸氫二鉀0.1克，蒸餾水I升，pH自然。上述三種培養基使用前在溫度121°C、壓力0.1MPa下，滅菌30 min。本專利技術通過銀杏內生真菌T-7的抗菌發酵液的抗菌試驗發現，該菌對供試5種植物病原真菌(番爺枯萎病菌(Fusarium oxysporum),蘋果腐爛病菌ΓCytosporamandshurica),蘋果炭 疽病菌gloeosporioides),梨黑星病菌(Yonturiapirina)，小麥赤霉病菌graminearum))的菌絲生長具有較為明顯的抑制作用。本專利技術以植物內生真菌作為資源，以求獲得抗植物病原真菌病害的新型農用抗生素類天然活性物。具體實施例方式本專利技術所述銀杏內生真菌T-7內生真菌抗植物病原菌發酵液的抗菌試驗如下: 1.植物病原真菌: 辣椒疫霉病菌{Phytoph thora capsici ),番爺枯萎病菌 ifusarium oxysporum),蘋果腐爛病菌(Pytospora mandshuri ca),蘋果炭疽病 HCo I Ietotrichumgloeospori oi des),梨黑星病菌 iyenturia pirina),小麥赤霉病 1^iFusariumgraminearum )； 2.病原微生物的培養 取植物病原真菌的斜面培養物分別接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板活化，在(28±1) °C恒溫箱中培養5天。3.內生真菌的培養: 本實施例所用銀杏內生真菌命名為腐皮鐮孢T-7 Q7UsariUm solani T_7),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為CGMCC N0.5089 ； 在無菌條件下，用接種環挑取少許銀杏內生真菌的菌種，轉接于已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板中，恒溫避光培養5天，培養溫度28°C ±1°C，得到活化菌種。4.T-7菌株發酵液制備 無菌條件下，利用接種環挑取3環活化菌種，接種于50ml的馬鈴薯葡萄糖液體培養基內，恒溫搖床培養2天，搖床轉速160轉/分，溫度28°C 土 1°C，得到一級種子；將一級種子，以10%接種量，接種于50ml的液體培養基中，恒溫搖床培養2天，搖床轉速160轉/分，溫度28°C ± I°C，得到二級種子； 將二級種子接種到50ml的液體培養基中，接種量10%，恒溫搖床培養7天，搖床轉速160轉/分，溫度28°C ± I°C，得到銀杏內生真菌發酵液；發酵液過濾除去菌絲體，無菌條件下，過0.22微米過濾器，即得到銀杏內生真菌T-7的抗菌發酵液； 發酵培養特征:培養第I天，菌體為少量淡粉色的粉末；培養第3天，淡粉色的細粉末減少，出現粉色的小菌絲球；培養第5天，粉紅色菌絲球繼續增多，體積變大，發酵液為橙紅色；培養第7天，出現大量紅色的菌絲球，體積變大，銀杏內生真菌T-7的抗菌發酵液為橙紅色； 上述馬鈴薯葡萄糖液體培養基的制備:馬鈴薯200克，葡萄糖20克、蒸餾水I升，pH自然； 上述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水I升; 上述液體培養基:蛋白胨15克，葡萄糖20克，硝酸鈉I克，氯化鈣0.5克，硫酸鎂0.1克，磷酸氫二鉀0.1克，蒸餾水I升，PH自然； 上述三種培養基使用前在溫度121°C、壓力0.1MPa下，滅菌30 min。5.抑制菌絲生長速率法測定抗菌活性 無菌條件下，在100毫升三角瓶中加入6毫升本專利技術制備的銀杏內生真菌抗菌發酵液和54毫升馬鈴薯葡萄糖瓊脂無菌融化的培養基，搖勻，分別取10毫升置于直徑為9厘米無菌培養皿內制成平板，待冷卻后在每個培養基平面上接入I個供試病原菌菌餅(直徑5毫米)，菌餅的菌絲面貼在培養基表面，將平板置于28±1°C避光培養72小時。采用十字交叉法測定菌落生長直徑，用下述公式計算本文檔來自技高網...
【技術保護點】
具有抗植物病原菌作用的銀杏內生真菌抗菌發酵液的制備方法，其特征在于：所述銀杏內生真菌命名為腐皮鐮孢T?7?(Fusarium?solani?T?7)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為CGMCC?No.5089；所述抗菌發酵液的具體制備操作步驟如下：（1）菌種活化?????在無菌條件下，用接種環挑取少許保藏的銀杏內生真菌的菌種，轉接于已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板中，恒溫避光培養5天，培養溫度28℃±1℃，得到活化菌種；（2）種子培養無菌條件下，利用接種環挑取3環活化菌種，接種于50ml的馬鈴薯葡萄糖液體培養基內，恒溫搖床培養2天，搖床轉速160轉/分，溫度28℃±1℃，得到一級種子；?將一級種子，以10%接種量，接種于50ml的液體培養基中，恒溫搖床培養2天，搖床轉速160轉/分，溫度28℃±1℃，得到二級種子；?（3）發酵培養將二級種子接種到50ml的液體培養基中，接種量10%，恒溫搖床培養7天，搖床轉速160轉/分，溫度28℃±1℃，得到銀杏內生真菌發酵液；發酵液過濾除去菌絲體，無菌條件下，過0.22微米過濾器，即得到銀杏內生真菌T?7的抗菌發酵液；發酵培養特征：培養第1天，菌體為少量淡粉色的粉末；培養第3天，淡粉色的細粉末減少，出現粉色的小菌絲球；培養第5天，粉紅色菌絲球繼續增多，體積變大，發酵液為橙紅色；培養第7天，出現大量紅色的菌絲球，體積變大，銀杏內生真菌T?7的抗菌發酵液為橙紅色；所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基：馬鈴薯?200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水1升；所述馬鈴薯葡萄糖液體培養基的制備：馬鈴薯200克，葡萄糖20克、蒸餾水1升，pH自然；所述液體培養基：蛋白胨15克，葡萄糖?20克，硝酸鈉1克，氯化鈣?0.5克，硫酸鎂0.1克，磷酸氫二鉀0.1克，蒸餾水1升，pH自然；上述三種培養基使用前在溫度121℃、壓力0.1MPa下，滅菌30?min。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：花日茂，柏鈺，操海群，吳祥為，徐慶慶，曾現銀，
申請(專利權)人：安徽農業大學，
類型：發明
國別省市：
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