一種喜樹堿新型藥源原料的制備方法技術

本發明專利技術屬于生物工程技術領域，是提高喜樹堿新型藥源植物短小蛇根草毛狀根中喜樹堿含量的方法。從長春花中克隆出CrORCA3和CrG10H基因的編碼框序列，構建含上述基因的植物雙價高效表達載體，以發根農桿菌介導法遺傳轉化短小蛇根草獲得轉CrORCA3和CrG10H基因的短小蛇根草毛狀根。獲得的轉基因短小蛇根草毛狀根中喜樹堿含量顯著提高，平均每瓶喜樹堿產量（2.62mg/flask）比對照增加了5.52倍，平均含量（8.44mg/g?DW）提高4.04倍。其中一個株系培養6周后經植物激素誘導后每瓶的喜樹堿總產量提高7.8倍。本發明專利技術為生產具重要臨床需求的抗癌藥物喜樹堿提供了一種新方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及的是一種生物工程
，特別是提高一種喜樹堿新型藥源原料短小蛇根草毛狀根中喜樹堿含量的方法，為商業化生產抗癌藥物喜樹堿提供一種新型藥源原料制備方法。
技術介紹
喜樹堿(Comptothecin, CPT )是一種喹啉類生物堿，是一類最初從喜樹(Camptotheca acuminata)中提取出的天然抗癌藥物,喜樹堿類藥物具有高效低毒和廣譜抗癌等諸多優點，是目前最有效的天然抗癌藥物之一，并且其抗癌機理非常獨特，是迄今為止發現的唯一一種通過抑制拓撲異構酶I發揮細胞毒性的天然植物活性成分，喜樹堿及衍生物與紫杉醇、維生素甲類化合物抗腫瘤作用的發現被譽為“20世紀90年代抗癌藥物的三大發現”。目前已有多種喜樹堿衍生物類藥物如依立替康(Irinotecan)和拓撲替康(Topotecan)獲得了美國食品藥物管理局(FDA)認證，在臨床上被廣泛用于治療卵巢癌、肺癌、結腸直腸癌以及白血病等多種惡性腫瘤，全球市場需求十分巨大。目前世界上喜樹堿類藥物的生產主要是從喜樹等植株中提取，然而由于喜樹天然資源數量有限，生長十分緩慢，喜樹堿及其類似物在植物體內含量又非常低，且提取環節多、費時費力，所以從天然喜樹中提取喜樹堿的方法已遠遠不能滿足人們對喜樹堿日益增長的需求。人們十分渴望能尋找到產喜樹堿的新資源如生長快速的草本植物，來作為研究喜樹堿生物合成及其分子調控機制的模式系統和生藥替代來源。短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)為菌草科蛇根草屬植物，全草藥用，性味苦寒，有清熱解毒之功效，民間常用全草治療外傷感染及腫毒等癥。更重要的是，早在1976年人們就發現了這種草本植物能產生天然抗癌物質喜樹堿及其衍生物(Tafur et al.，1976)。但令人遺憾的是，直到最近幾年人們才開始意識到蛇根草屬植物所具有的巨大藥用價值和商業開發潛力。由于短小蛇根草作為一種產喜樹堿的草本植物比木本植物喜樹具有更多的研究優勢如生長快周期短，易于遺傳轉化及植株再生等，所以，短小蛇根草是一種開展喜樹堿生物合成的分子調控和代謝工程研究的優良材料。多年來，國內外學者圍繞著擴大喜樹堿藥源問題進行了諸多領域的研究如化學全合成，半合成及細胞培養等，并取得了一定的進展。喜樹堿的化學全合成雖然已經成功，但因成本太高、產量太低、周期太長且易造成環境污染等因素而限制了其商業化生產；半合成方法雖然是目前最有效的途徑之一，但其前體的提取分離仍然依賴于天然資源的供應；細胞懸浮培養則存在喜樹堿含量低微及穩定性較差等問題同樣難以實現工業化生產(Hengelet all992)。相比之下，利用基因工程技術將喜樹堿生物合成途徑中的關鍵酶基因導入產喜樹堿的資源植物中，繼而獲得轉基因的發根系或再生植株等，并進行大規模的培養是實現從根本上提高喜樹堿含量的最佳途徑之一(Lorence and Nessler2004, Lu et al2008)。大量研究表明，異胡豆苷合成酶(STR)，色氨酸脫羧酶(Tryptophandecarboxylase, TDC),香葉醇-10-輕化酶(GeraniollO-hydroxylase, G10H)及 1-脫氧木酮糖 _5_ 憐酸合成酶(l-Deoxy-D-Xylulose5_Phosphate Synthase, DXS)等關鍵酶在包括喜樹堿在內的TIAs的生物合成中具有重要作用(Canel et all998 ；De Luca et all989 ；Lopez-Meyer1997 ；Yamazaki et al2003 ；McKnight et all990 ；Kutchanl989 ；Yamazaki etal2003 ；Lu et al2008)。另外，近年來轉錄因子正逐漸被認為是一種能有效地調控植物次生代謝途徑的新手段。通過超量表達轉錄因子，能夠有效地克服多基因共轉化存在的弊端，全面上調能被其調控的相關基因的表達水平，對整個次生代謝途徑的調控效果要比單純依賴單個(或多個)結構基因的增強表達好得多。例如van der Fits和Memelink (2000)在SCIENCE上報道發現一個受茉莉酸甲酯誘導并能夠調控植物初級和次生代謝的中央轉錄調控因子 0RCA3 (Octadecanoie-responsive Cantharanthus AP2_domain protein3),能增強TIAs生物合成代謝途徑中絕大多數催化酶基因的協同表達，從而有效地調控長春花(Catharanthus roseus)中TIAs的生物合成,充分展示了用轉錄調節因子來調控TIAs生物合成的巨大潛力。0RCA3的發現為調控喜樹堿的代謝合成提供了一種新的研究切入點。必須指出的是轉錄因子并非萬能的，單轉化一個0RCA3基因，雖然可以調控諸如AS，TDC，DXS，CPR和STR等多個關鍵酶基因的協同表達，但是有些基因如關鍵酶基因GlOH并不受0RCA3的調控。在0RCA3基因過量表達的細胞中由于關鍵酶基因GlOH的表達不足，從而限制了 TIA代謝終產物如長春堿的產量沒有得到顯著提高。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服常規技術中的不足，提供，可有效提高短小蛇根草毛狀根中喜樹堿含量。本專利技術還提供了實現上述方法的重組載體。本專利技術利用已克隆的長春花Cr0RCA3和CrGlOH基因，構建含上述基因的植物雙價高效表達載體，以發根農桿菌(如C58C1等)為介導，將Cr0RCA3和CrGlOH基因同時導入短小蛇根草莖段中并再生出毛狀根；PCR和熒光定量PCR檢測目的基因Cr0RCA3和CrGlOH的整合和表達情況，高效液相色譜測定短小蛇根草轉基因毛狀根中喜樹堿含量。技術方案為:，用轉錄因子0RCA3和關鍵酶GlOH雙基因共轉化提高喜樹堿含量，包括如下具體步驟:(I)將轉錄因子基因(Cr0RCA3 基因，SEQ ID N0.1，GenBank:EU072424.1)和香葉醇-10-羥化酶基因(CrGlOH基因，SEQ ID N0.2,GenBank:AJ251269.1)插入植物表達載體，構建重組載體；以長春花幼苗RNA為模板PCR獲得Cr0RCA3和CrGlOH基因片段；植物表達載體可選用pCAMBIA質?；騪BI質粒，尤其是pCAMBIA1304質粒；(2)將步驟(I)所獲得的重組載體轉入發根農桿菌，構建含有重組載體的發根農桿菌；發根農桿菌可選用發根農桿菌菌株C58C1、發根農桿菌菌株A4或發根農桿菌菌株L BA9402 ；(3)利用所構建的含有重組載體的發根農桿菌菌株遺傳轉化短小蛇根草，優選為短小蛇根草的莖段，獲得毛狀根；(4)檢 測步驟(3)毛狀根中的Cr0RCA3和CrGlOH基因，取篩選結果為陽性的轉基因毛狀根克??；檢測方法為PCR 及 Southern blotting 檢測。PCR陽性的轉基因毛狀根克隆進行Southern blot檢測，證明目的基因Cr0RCA3和CrGlOH已整合到短小蛇根草毛狀根基因組中；熒光定量PCR測定Cr0RCA3和CrGlOH在短小蛇根草轉基因毛狀根中的表達情況；高效液相色譜法測定短小蛇根草轉基因毛狀根中喜樹堿含量，進一步篩選喜樹堿和羥基喜樹堿含量顯著提高的短小蛇根草轉基因毛狀根株系。所述的PCR檢測中，分別本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種喜樹堿新型藥源原料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）將轉錄因子基因CrORCA3和關鍵酶香葉醇?10?羥化酶基因CrG10H插入植物表達載體，構建重組載體；（2）將步驟（1）所獲得的重組載體轉入發根農桿菌，構建含有重組載體的發根農桿菌；（3）利用所構建的含有重組載體的發根農桿菌菌株遺傳轉化短小蛇根草，獲得毛狀根；（4）檢測步驟(3)毛狀根中的CrORCA3和CrG10H基因，取篩選結果為陽性的轉基因毛狀根克隆。（5）利用植物激素對獲得的轉基因毛狀根進行誘導，使其喜樹堿含量進一步提高。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：滕小娟，開國銀，李姍姍，郝小龍，崔麗潔，
申請(專利權)人：上海師范大學，
類型：發明
國別省市：