一種利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲取喜樹(shù)堿新型藥源的方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是提高喜樹(shù)堿新型藥源植物短小蛇根草毛狀根中喜樹(shù)堿含量的方法。從長(zhǎng)春花中克隆異胡豆苷合成酶和香葉醇-10-羥化酶基因的編碼框序列，構(gòu)建含上述基因的植物雙價(jià)高效表達(dá)載體，以發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化短小蛇根草獲得轉(zhuǎn)CrSTR和CrG10H基因的短小蛇根草毛狀根；利用植物激素誘導(dǎo)處理高產(chǎn)喜樹(shù)堿株系，獲得了喜樹(shù)堿含量為4.703mg/g?DW的高產(chǎn)毛狀根。MTT檢測(cè)證明，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方式獲得的喜樹(shù)堿粗提物具有良好的生物活性，腫瘤細(xì)胞殺傷力達(dá)35.9%。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)為獲取喜樹(shù)堿提供了一種新型藥源，也為生產(chǎn)具重要臨床需求的抗癌藥物喜樹(shù)堿提供了一種新方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及生物工程
，特別是一種利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲提高短小蛇根草毛狀根中喜樹(shù)堿含量的方法，為商業(yè)化生產(chǎn)抗癌藥物喜樹(shù)堿提供一種新型藥源原料制備方法。
技術(shù)介紹
喜樹(shù)堿(Comptothecin, CPT )是一種喹啉類(lèi)生物堿，是一類(lèi)最初從喜樹(shù)(Camptotheca acuminata)中提取出的天然抗癌藥物,喜樹(shù)堿類(lèi)藥物具有高效低毒和廣譜抗癌等諸多優(yōu)點(diǎn)，是目前最有效的天然抗癌藥物之一，并且其抗癌機(jī)理非常獨(dú)特，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I發(fā)揮細(xì)胞毒性的天然植物活性成分，喜樹(shù)堿及衍生物與紫杉醇、維生素甲類(lèi)化合物抗腫瘤作用的發(fā)現(xiàn)被譽(yù)為“20世紀(jì)90年代抗癌藥物的三大發(fā)現(xiàn)”。目前已有多種喜樹(shù)堿衍生物類(lèi)藥物如依立替康(Irinotecan)和拓?fù)涮婵?Topotecan)獲得了美國(guó)食品藥物管理局(F DA)認(rèn)證，在臨床上被廣泛用于治療卵巢癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌以及白血病等多種惡性腫瘤，全球市場(chǎng)需求十分巨大。目前世界上喜樹(shù)堿類(lèi)藥物的生產(chǎn)主要是從喜樹(shù)等植株中提取，然而由于喜樹(shù)天然資源數(shù)量有限，生長(zhǎng)十分緩慢，喜樹(shù)堿及其類(lèi)似物在植物體內(nèi)含量又非常低，且提取環(huán)節(jié)多、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所以從天然喜樹(shù)中提取喜樹(shù)堿的方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足人們對(duì)喜樹(shù)堿日益增長(zhǎng)的需求。人們十分渴望能尋找到產(chǎn)喜樹(shù)堿的新資源，如生長(zhǎng)快速的草本植物，來(lái)作為研究喜樹(shù)堿生物合成及其分子調(diào)控機(jī)制的模式系統(tǒng)和生藥替代來(lái)源。短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)為菌草科蛇根草屬植物,全草藥用，性味苦寒，有清熱解毒之功效，民間常用全草治療外傷感染及腫毒等癥。更重要的是，早在1976年人們就發(fā)現(xiàn)了這種草本植物能產(chǎn)生天然抗癌物質(zhì)喜樹(shù)堿及其衍生物(Tafur et al.，1976)。但令人遺憾的是，直到最近幾年人們才開(kāi)始意識(shí)到蛇根草屬植物所具有的巨大藥用價(jià)值和商業(yè)開(kāi)發(fā)潛力。由于短小蛇根草作為一種產(chǎn)喜樹(shù)堿的草本植物比木本植物喜樹(shù)具有更多的研究?jī)?yōu)勢(shì)如生長(zhǎng)快周期短，易于遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生等，所以，短小蛇根草是一種開(kāi)展喜樹(shù)堿生物合成的分子調(diào)控和代謝工程研究的優(yōu)良材料。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞著擴(kuò)大喜樹(shù)堿藥源問(wèn)題進(jìn)行了諸多領(lǐng)域的研究如化學(xué)全合成，半合成及細(xì)胞培養(yǎng)等，并取得了一定的進(jìn)展。喜樹(shù)堿的化學(xué)全合成雖然已經(jīng)成功，但因成本太高、產(chǎn)量太低、周期太長(zhǎng)且易造成環(huán)境污染等因素而限制了其商業(yè)化生產(chǎn)；半合成方法雖然是目前最有效的途徑之一，但其前體的提取分離仍然依賴(lài)于天然資源的供應(yīng)；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)則存在喜樹(shù)堿含量低微及穩(wěn)定性較差等問(wèn)題同樣難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)(Hengelet all992)。相比之下，利用基因工程技術(shù)將喜樹(shù)堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因?qū)氘a(chǎn)喜樹(shù)堿的資源植物中，繼而獲得轉(zhuǎn)基因的發(fā)根系或再生植株等，并進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)從根本上提高喜樹(shù)堿含量的最佳途徑之一(Lorence and Nessler2004, Lu et al2008)。研究表明喜樹(shù)堿生物合成途徑中的兩個(gè)前體物質(zhì)色胺(tryptamine)和裂環(huán)馬錢(qián)子苷(secologanin)分別由上游途徑:莽草酸途徑(Shikimate Pathway)/卩引哚途徑(Indole Pathway)和 MEP(2_C_ 甲基-D-赤蘚糖醇 _4_ 憐酸)途徑提供(Yamazaki etal2004、Carolis et all994、唐中華 et al2003)。在卩引哚途徑中分支酸(chorismate)在鄰氨基苯甲酸合成酶(anthranilate synthase, AS)催化下形成鄰氨基苯甲酸(anthranilate)。鄰氨基苯甲酸再經(jīng)多步反應(yīng)得到色氨酸(tryptophan),色氨酸在色氨酸脫羧酶(tryptophan decarbosylase, TDC)的催化作用下形成色胺。在MEP途徑中的香葉醇-10-羥化酶(GlOH)是關(guān)鍵限速酶，該酶催化香葉醇形成10-羥基香葉醇，再經(jīng)多步反應(yīng)形成下游產(chǎn)物——裂環(huán)馬錢(qián)子苷；異胡豆苷合成酶(STR)是催化色胺和裂環(huán)馬錢(qián)子苷合成吲哚類(lèi)生物堿共同前體——異胡豆苷(Strictosidine)的關(guān)鍵酶。來(lái)自莽草酸途徑的色胺和裂環(huán)馬錢(qián)子苷在STR的催化下形成異胡豆苷，該步反應(yīng)是整個(gè)萜類(lèi)吲哚生物堿合成的中心反應(yīng)。異胡豆苷在異胡豆苷β-D-糖苷酶(Strictosidine β -D-glucosidase, SGD)作用下轉(zhuǎn)化成直夾竹桃唳苷(Strictosamide)后,再經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)最終生成喜樹(shù)堿。目前，由直夾竹桃啶苷到喜樹(shù)堿的下游合成途徑尚未明了，僅檢測(cè)到個(gè)別中間產(chǎn)物如山松醇苷/短小蛇根草苷(3-S-Pumi1side)和脫氧山松醇苷(3-S_Deoxypumi1side)(關(guān)水 et al2004、王磊et al2008)。采用基因工程手段將上述的兩個(gè)關(guān)鍵酶基因STR和GlOH來(lái)共同轉(zhuǎn)化產(chǎn)喜樹(shù)堿的植物短小蛇根草，將有可能打破喜樹(shù)堿生物合成途徑的瓶頸效應(yīng)，獲得高產(chǎn)喜樹(shù)堿的短小蛇根草毛狀根或者再生植株，為商業(yè)化生產(chǎn)喜樹(shù)堿和羥基喜樹(shù)堿提供新型優(yōu)質(zhì)藥源。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于克服常規(guī)技術(shù)中的不足，提供一種有效提高產(chǎn)喜樹(shù)堿的新型草本藥源植物短小蛇根草毛狀根中喜樹(shù)堿含量的方法。本專(zhuān)利技術(shù)利用已克隆的長(zhǎng)春花CrSTR和CrGlOH基因，構(gòu)建含上述基因的植物雙價(jià)高效表達(dá)載體，以發(fā)根農(nóng)桿菌(如C58C1等)為介導(dǎo)，將CrSTR和CrGlOH基因同時(shí)導(dǎo)入短小蛇根草莖段中并再生出毛狀根；PCR和熒光定量PCR檢測(cè)目的基因CrSTR和CrGlOH的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜測(cè)定短小蛇根草轉(zhuǎn)基因毛狀根中喜樹(shù)堿含量。技術(shù)方案為:一種用于提高喜樹(shù)堿含量的重組載體，含有異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇-10-羥化酶基因CrGlOH。關(guān)鍵酶基因CrSTR和GlOH雙基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹(shù)堿含量的方法，包括如下具體步驟:(1)將異胡豆苷合成酶基因(CrSTR 基因，SEQ ID N0.1，GenBank:X53602.1)和香葉醇-10-羥化酶基因(CrGlOH基因，SEQ ID N0.2, GenBank:AJ251269.1)插入植物表達(dá)載體，構(gòu)建重組載體；以長(zhǎng)春花幼苗RNA為模板PCR獲得CrSTR和CrGlOH基因片段；植物表達(dá)載體可選用pCAMBIA質(zhì)粒或pBI質(zhì)粒，尤其是pCAMBIA1304質(zhì)粒；(2)將步驟(1)所獲得的重組載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，構(gòu)建含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌；發(fā)根農(nóng)桿菌可選用發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4或發(fā)根農(nóng)桿菌菌株L BA9402 ；(3)利用所構(gòu)建的含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化短小蛇根草，優(yōu)選為短小蛇根草莖段，獲得毛狀根；(4)檢測(cè)步驟(3)毛狀根中的CrSTR和CrGlOH基因，取篩選結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因毛狀根克隆；(5)利用植物激素對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根進(jìn)行誘導(dǎo)，使其喜樹(shù)堿含量進(jìn)一步提高。所述的植物激素為茉莉酸、脫落酸、水楊酸或二甲基亞砜。將步驟(4)篩選得到的毛狀根液體培養(yǎng)35 45天后，用濃度為80 200 μ M水楊酸或二甲基亞砜誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因毛狀根3 7天，或者用濃度為80 200 μ M的茉莉酸或脫落酸誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因毛狀根7天。毛狀根的液體培養(yǎng)液中，喜樹(shù)堿含量有很大提高。優(yōu)選的,步驟(4)中的檢測(cè)方法為PCR及本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲取喜樹(shù)堿新型藥源的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)將異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇?10?羥化酶基因CrG10H插入植物表達(dá)載體，構(gòu)建重組載體；(2)將步驟（1）所獲得的重組載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，構(gòu)建含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌；(3)利用所構(gòu)建的含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化短小蛇根草，獲得毛狀根；(4)檢測(cè)步驟（3）毛狀根中的CrSTR和CrG10H基因，取篩選結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因毛狀根克隆；(5)利用植物激素對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根進(jìn)行誘導(dǎo)，使其喜樹(shù)堿含量進(jìn)一步提高。

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：滕小娟，開(kāi)國(guó)銀，季倩，時(shí)敏，崔麗潔，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：上海師范大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：