本發明專利技術提出了一種能夠大規模并快速高純度地誘導間充質干細胞轉決定成造血干細胞的方法，包括下列步驟：1）制備均質的間充質干細胞的培養基；2）多種小RNA分子的組合；3）核酸多肽納米粒的組裝和轉染；4）轉決定后的造血干細胞誘導擴增培養基；5）激活多種造血相關的基因，解決了現有技術造血干細胞治療中的細胞配型困難、免疫排斥和造血干細胞數量限制的技術瓶徑的問題。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，特別是指。
技術介紹
脂肪源性干細胞(Adipose-derived stem cell, AD-MSCs)的主要來源白色脂肪(white adipose tissue, WAT)在體內分布廣泛,儲量豐富。細胞克隆實驗證明，骨髓來源的間充質干細胞(Bone-marrow mesenchymal stem cell, BMSCs)僅占成人骨髓的0.2 X IO^5-0.1 X 10_5，而脂肪組織中所獲得的干細胞克隆形成率是BMSCs的100-500倍。骨髓中BMSCs的比例和增值能力均會隨著年齡的增長和骨質疏松的發生率而下降，但脂肪組織中ADSCs數量不隨供者年齡增加而減少。ADSC體外擴增和自我更新能力強，原代培養約5-7天后，細胞融合超過90%，一個月出現3個對數生長期，能較穩定傳代20代以上；體外培養時對血清無特殊選擇性，無需添加物即可良好的生長，液氮凍存和長期傳代后的ADSCs細胞生長和表型均無改變。ADSCs具有多向分化能力，在不同誘導培養條件下，ADSCs能夠定向分化成成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、胰腺內分泌樣細胞、肝臟細胞和視神經細胞等多種組織細胞。但至今不清楚它們是否能轉化為造血干細胞(HSCs)。造血干細胞是治療血液病尤其是白血病的最有效方法。白血病和其它腫瘤疾病一樣，近年來在中國有著顯著增長的趨勢，并呈現低齡化的特點。白血病占惡性腫瘤的5%，發病以兒童和青年居多。治療白血病的最有效的方法就是造血干細胞治療。但目如的治療手段是通過尋找配型的骨髓或 造血干細胞，患者家屬以及社會的相關部門動用一切可調動的資源尋找配型適合的造血干細胞，能配上的微乎其微。因此催生了國家干細胞庫的設立，但每個庫通常要花費2億元左右，其經濟成本之高可想而知，但從技術上乃不能完全排除免疫排斥和致瘤可能。此外，由于干細胞的數量有限，無分化擴增技術的缺少，使最終優質的醫療結果得不到保證。上述種種原因急需人們去發現新的產生造血干細胞的來源和研制新的無分化擴增造血干細胞的技術和方法。近年來的研究發現不同類型的造血細胞中小RNA的表達顯著不同，而且這種不同在細胞的發育過程中起著重要的調節作用。例如，miR-181和B-淋巴細胞的發育有關，miR-142和miR-223與T-淋巴細胞的發育有關，miR-221和miR-222與人的紅細胞生成有關，miR-223和小鼠的粒細胞分化相關，而miR-10，miR-126和miR-17與巨核細胞減少有關。除此之外，人們還發現某些小RNA，如miR-128和miR-181，能起到阻止造血干細胞分化的作用。盡管已經發現某些miRNA，例如miR-130a和miR-10a，通過作用H0XA1基因和MAFB基因的轉錄因子基因從而誘導細胞分化
技術實現思路
本專利技術提出，解決了現有技術造血干細胞治療中的細胞配型困難、免疫排斥和造血干細胞數量限制的技術瓶徑的問題。本專利技術的技術方案是這樣實現的:，包括下列步驟:1)制備均質的間充質干細胞的培養基；2)多種小RNA分子的組合；3)核酸多肽納米粒的組裝和轉染；4)轉決定后的造血干細胞誘導擴增培養基；5)激活多種造血相關的基因。作為優選的技術方案，所述培養基是指在無血清的高糖DMEM/F12培養基中添的EGF, FGF-2, IPDGF, IGF 和 TGF-β 五因子。作為優選的技術方案，所述培養基是指在無血清的高糖DMEM/F12培養基中添的shh, SCF，ΤΡ0, Flt3L, Deltal, IGFBP, Angiopoietin, MBP4, LIF, TGF-β 十因子。作為優選的技術方案，所述多種小RNA分子是指miR-138-1，miR-138-2, miR-433以及靶向EIDlmRNA不同位點的siR-EIDl分子的序列。所述祀向EIDlmRNA不同位點的siR-EIDl分子的序列見表2。作為優選的技術方案，所述轉決定后的造血干細胞培養是指在造血干細胞誘導擴增培養基中以5X 105/ml的細胞密度進行培養至少3天。核酸多肽納米粒的組裝是指不同的小RNA分子與多肽轉染試劑按實例3配比、程序和時間的配制過程，通過每天一次共二次的轉染以達到最佳的誘導效率。作為優選的技術方案，所述激活多種造血相關的基因是指Runxl，Bmil, HoxB4, Gatal, Gata2, Gfil, Sall4, Pu.1, Scl, Md, C-myc, C-myb, Kcl4, Cxcr4,和 Crb,但不局限于這些基因。間充干細胞培養基配方可制造成不同的培養試劑盒，其中包括不同間充質干細胞增殖所需要的細胞增殖因子、細胞分化抑制劑。 造血干細胞誘導擴增培養基配方可制造成不同的培養試劑盒，其中包括造血干細胞增殖所需要的細胞增殖因子、細胞分化抑制劑。具體配方成分見表3。使用本專利技術的方法獲得的誘導造血干細胞，可用于血液病如再生障礙性貧血和白血病的治療。下面結合具體實例進一步說明本專利技術。實例1.間充質干細胞分離、培養和擴增脂肪/骨髓/臍帶的獲取在捐獻者同意的前提下進行的。人脂肪來源干細胞的采集、分離和培養:脂肪抽吸物被分為2種成分:一種是密度小的脂質成分，另一種是密度大的水性成分，為液體部分。液體成分被用作脂肪來源干細胞的來源。無菌條件下將獲取的脂肪組織用同體積的PBS液反復沖洗3到5次，加入0.1% I型膠原酶，37°C水浴振蕩、消化60min，然后以含10%胎牛血清的DMEM培養基終止消化。IOOOg離心lOmin，棄上清液及懸浮的殘存組織，重懸細胞，加入2倍體積的紅細胞裂解液(NH4C1154mmol/L+KHC0310mmol/L+EDTA0.lmmol/L)靜置lOmin，離心、 棄上清液。用適量的PBS液清洗3次，200目篩網過濾，細胞懸液用細胞記數板記數，按每平方厘米1-3 X IO5細胞接種于150cm2的培養瓶，加20mL無血清的高糖 DMEM/F12 培養基，添加 20ng/ml EGF, 20ng/ml FGF-2, 10ng/mlPDGF-BB, 5ng/ml IGF和0.5ng/ml TGF- β混合均勻，置于37°C、5%的CO2飽和濕度培養箱內培養。本專利技術公開的培養基是一種快速擴增無分化的間充質干細胞培養液，它能培養出高度一致的無分化的間充質干細胞，為后續的產生造血干細胞提供了可靠的保證。相差顯微鏡觀察細胞形態特征及增殖情況，36 48h后首次換液，以后每72h換液I次。待細胞融合超過培養瓶底80%時，常規胰酶消化傳代。人脂肪來源干細胞的鑒定:取第3或4代細胞以0.25%胰酶消化后，流式細胞術分析研究發現 ADSCs 主要表達 CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD29、CD49e 和 HLA-ABC，而不表達⑶34、⑶3、⑶19、⑶45、⑶14、⑶31、⑶62L、⑶95L和HLA-DR (見附圖說明圖1)。這個結果和其他的MSCs幾乎一致。但ADSCs與BMSCs也有差別:大部分BMSCs表達CDlO和CD106，而表達CDlO的ADSCs僅占5% 20% ;幾乎所有的ADSCs表達CD49f和CD54，而BMSCs極少表達。實例2.miRNAs本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種能夠大規模并快速高純度地誘導間充質干細胞轉決定成造血干細胞的方法，其特征在于，包括下列步驟：1）制備均質的間充質干細胞的培養基；2）多種小RNA分子的組合；3）核酸多肽納米粒的組裝和轉染；4）轉決定后的造血干細胞誘導擴增培養基；5）激活多種造血相關的基因。
【技術特征摘要】
1.一種能夠大規模并快速高純度地誘導間充質干細胞轉決定成造血干細胞的方法，其特征在于，包括下列步驟: 1)制備均質的間充質干細胞的培養基； 2)多種小RNA分子的組合； 3)核酸多肽納米粒的組裝和轉染； 4)轉決定后的造血干細胞誘導擴增培養基； 5)激活多種造血相關的基因。2.按權利要求1所述的一種能夠大規模并快速高純度地誘導間充質干細胞轉決定成造血干細胞的方法，其特征在于:所述培養基是指在無血清的高糖DMEM/F12培養基中添的EGF, FGF-2, PDGF-BB, IGF 和 TGF- β 五因子。3.按權利要求1所述的一種能夠大規模并快速高純度地誘導間充質干細胞轉決定成造血干細胞的方法，其特征在于:所述培養基是指在無血清的高糖DMEM/F12培養基中添的shh, SCF，TPO, Flt3L, Deltal, IGFBP, Angiopoietin, MBP4, LIF, TGF-β 十因子。4.按權利要求 1所述的一種能夠大規模并快速高純度地誘導間充質干細胞轉決定成造血干細胞的方法，其特征在于:所述多種小RNA分子是指miR-138-l，miR-138-2，miR-433以及靶向EIDlmRNA不同位點的siR-EIDl分子的序列。5.按權利要求1所述的一種能夠大規模并快速高純度地誘導間充質干細胞轉決定成造血干細胞的方法，其特征在于:所述轉...
【專利技術屬性】
技術研發人員：殷勤偉，黃兵，
申請(專利權)人：黃兵，
類型：發明
國別省市：
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