一種玉米胚乳瞬時表達外源基因的方法技術

本發明專利技術公開了一種玉米胚乳瞬時表達外源基因的方法，采用基因槍轟擊轉化授粉后9天的胚乳，轟擊壓力為900psi，轟擊距離6cm。本發明專利技術解決了胚乳特異表達基因和啟動子的瞬時表達難題，為胚乳特異性表達啟動子活力驗證，順式作用元件鑒定，外源基因功能鑒定提供技術支撐。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及基因工程技術，尤其涉及的是一種玉米胚乳瞬時表達外源基因的方法。
技術介紹
瞬時表達以活體植株作為實驗材料，能夠準確的反應基因在植物體內的實際功能，是一種快速、簡便、高效的基因功能分析法，已經在多種植物中得到應用（Xu?et.al.，2001；Mitsui?et.al.，2003；Wydro?et.al.，2006）。瞬時表達的轉化方法有農桿菌轉化法、基因槍轟擊法以及原生質體轉化法幾種。這幾種方法各有優劣，對于定性研究，農桿菌轉化法較為理想，它操作簡便，成本很低，缺點是每次只能轉化一個質粒，由于轉化效率的因素，不可能做到每次轉化的細胞數都是一致的，因此，對于定量研究基因的功能是不夠準確的。而且，由于物種的限制，一些植物組織農桿菌較容易侵染，轉化效率較高，而許多植物，特別是單子葉植物的組織是不容易受農桿菌侵染的，不適合于用農桿菌侵染法。原生質體轉化法在擬南芥和玉米黃化苗葉片以及水稻懸浮細胞中已經應用成功（Chiu?et.al.，1996；Lu?et.al.，1998；Sheen?et.al.，2001），這種轉化方法可以同時向細胞中轉入多個質粒，因此，轉化時可以加入一個含有報告基因的內參質粒，用來檢測每次轉化的效率，從而糾正每次實驗中轉化效率不同而產生的誤差，對于要求定量研究是一個理想方法。雖然原生質體轉化法是一種簡便高效的轉化方法，但是對于材料有很大的限制，有研究顯示，擬南芥葉片的原生質體轉化中，對于擬南芥的生長狀態和生長時期有較高的要求（Sheen?et.al.，2001）；玉米葉片原生質體轉化也僅限于用2-3葉期的黃化苗制作的原生質體，而其它時期的葉片或含有葉綠體葉片或者其它組織原生質體轉化目前非常困難（Chiu?et.al.，1996）。水稻懸浮細胞的局限性主要在于懸浮細胞的獲得，懸浮細胞的培養需要經過愈傷組織多次繼代后，再用液體培養基振蕩培養，使松散的愈傷組織分散到液體培養基中才能獲得懸浮細胞（Lu?et.al.，1998），這是一個耗時耗力的過程。除了以上三種材料外，其它植物材料的原生質體轉化方法還鮮見報道。基因槍轟擊轉化法是一個物理過程，最大的優點是轉化材料不受物種限制，而且操作簡便。目前已經報道的基因槍轟擊法介導的瞬時表達在多種植物中已經得到應用（Luan?et.al.，1992；Xu?et.al.，2001；Miki?et.al.，2004；Selth?et.al.，2004；Ueki?et.al.，2009）。Marzábal等（1998）曾利用授粉后15-17天的玉米胚乳進行瞬時表達分析了γ-zein基因啟動子中的兩個順式作用元件，我們根據Marzábal等報導的方法，在授粉后15-17天的玉米胚乳中沒能成功瞬時表達外源基因。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種玉米胚乳瞬時表達外源基因的方法。本專利技術的技術方案如下：一種玉米胚乳瞬時表達外源基因的方法，采用基因槍轟擊轉化授粉后9天的胚乳，轟擊壓力為900psi，轟擊距離6cm。本專利技術技術解決了胚乳特異表達基因和啟動子的瞬時表達難題，為胚乳特異性表達啟動子活力驗證，順式作用元件鑒定，外源基因功能鑒定提供技術支撐。附圖說明圖1為：授粉后不同天數的玉米胚乳在不同壓力和不同轟擊距離下的轉化效率；A-F分別為：7DAP胚乳，9DAP胚乳，11DAP胚乳，13DAP胚乳，15DAP胚乳，20DAP胚乳；圖2為部分轟擊條件下胚乳的染色情況（7DAP胚乳，6cm）1-4：1300psi，1100psi，900psi，650psi；圖3為ZmSSI啟動子驅動的GUS在9DAP胚乳中的染色情況；1-2：轟擊2槍，轟擊1槍；具體實施方式以下結合具體實施例，對本專利技術進行詳細說明。我們對玉米胚乳瞬時表達的轉化條件進行了摸索和優化。結果發現，對于灌漿后不同時期的玉米胚乳，轉化效率存在很大的差異，授粉后7-11天的胚乳能夠有效進行轉化，其中以授粉后9天的胚乳轉化效果最好，而授粉11天以后，隨著授粉后天數的推移，轉化效果隨之明顯降低，幾乎降為零（圖1）。從剝離的胚乳外觀可以發現，授粉后7-9天的胚乳呈現的是透明狀，里面幾乎沒有淀粉等貯藏物質，而授粉后11天的胚乳已經開始變渾濁，說明細胞里面開始合成淀粉等貯藏物質了，隨著授粉后天數的推移，胚乳由透明的果凍狀逐漸變成白色的固體，而轉化效果也隨之迅速降低。說明胚乳細胞內淀粉等貯藏物質的合成是干擾胚乳基因槍轉化的主要因素。其原因可能是授粉13天后胚乳細胞里造粉體內開始大量合成淀粉，眾多含有淀粉的造粉體包圍在胚乳的細胞核外，阻止了基因槍轟擊的金粉進入細胞核，從而大大降低了轉化效率。除材料的自身因素外，影響基因槍轉化效率的因素還有轟擊壓力、轟擊距離以及轟擊的次數等。轟擊壓力大時，金粉的穿透力強，但是可能損壞細胞，轟擊壓力小時，能有效保護細胞，但穿透力弱，有可能不能將金粉有效打入細胞核。轟擊距離的遠近也是同理。對于以上幾個參數的摸索發現，900psi的轟擊壓力能獲得最高的轉化效果（圖2），轟擊距離以6cm為最佳。對于授粉后9天的胚乳在最佳轟擊條件下，轟擊一次與轟擊兩次得到的結果差異不顯著（圖3），說明轟擊次數對轉化效率影響不明顯。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本專利技術所附權利要求的保護范圍。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種玉米胚乳瞬時表達外源基因的方法，其特征在于，采用基因槍轟擊轉化授粉后9天的胚乳，轟擊壓力為900psi，轟擊距離6cm。

【技術特征摘要】
1.一種玉米胚乳瞬時表達外源基因的方法，其特征在于，采用基因槍轟擊轉化<...

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃玉碧，胡育峰，張軍杰，劉漢梅，劉應紅，
申請(專利權)人：四川農業大學，
類型：發明
國別省市：