本發明專利技術公開了一種利用反義寡核苷酸沉默擬南芥內源miRNA的方法，屬于反義寡核苷酸的應用技術領域。本發明專利技術的方法是用miRNA反義寡核苷酸的水溶液浸泡擬南芥根系，使miRNA反義寡核苷酸導入植物細胞，從而實現在植物活體中特異性地沉默目標miRNA。該方法具有操作簡便快捷，干擾效果顯著、穩定持久的優點，避免了現有方法由于依賴轉基因技術因而實驗周期長、費時費力的缺點；同時也打破了利用糖溶液介導實現反義寡核苷酸跨膜運輸的局限性，為擬南芥miRNA功能研究提供了新的技術手段。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種利用反義核苷酸沉默擬南芥內源miRNA的方法。
技術介紹
MicroRNA (miRNA)是一類約22nt的內源非編碼小分子RNA。在真核生物中，miRNA通過與靶mRNA互補配對結合，以抑制基因翻譯或剪切mRNA的方式，起到轉錄后負數調控的作用。對擬南芥、水稻等模式植物的研究顯示，植物miRNA不僅調控根系發生、開花時序等多種生長發育過程，而且在氧自由基、干旱、鹽分、嚴寒和無機營養缺失等脅迫響應中也起重要作用。miRNA作為廣泛分布的轉錄后調節因子，已日益成為功能基因組研究中不可缺少的組分，但絕大部分miRNA的功能尚不清楚。目前，在擬南芥中對miRNA進行功能研究的手段主要有兩種1)通過靶基因模擬(target mimics)的策略,利用過表達目標miRNA祀基因的類似物，間接實現knockdown目標miRNA的活性；2)通過人工miRNA (artificial miRNA, amiRNA)技術,利用過表達目標miRNA的前體，實現增強miRNA的活性。上述方法均以構建靶基因或miRNA前體的表達載體為前提，并需要利用轉基因技術獲得穩定遺傳的轉基因植株或者利用病毒轉染進行瞬時表達。反義miRNA 寡核苷酸(Anti-miRNA Oligodeoxyribonucleotide, AMO)是經化學修飾并與miRNA成熟體互補的單鏈RNA，其通過Waston-Crick堿基配對與細胞內源miRNA特異結合形成雜交分子，通過空間位阻效應抑制特定目標miRNA的功能。未修飾的RNA很容易被細胞內的核酸酶降解而失效，因此AMO —般都經化學修飾以增加其穩定性。常用修飾有 2’ - O-甲基化(2，-Ο-methyl)、2’ -O-甲氧乙基化(2，-O-methoxyethyl, 2’ -Μ0Ε)、鎖核酸(Lock nucleotide acid, LNA)等。由于寡核苷酸和細胞膜均帶負電荷，因此在沒有介導的情況下寡核苷酸不容易直接進入細胞。動物中，通過將AMO顯微注射入胚胎或者轉染細胞系，可以實現快速抑制miRNA活性。植物具有細胞壁，因此盡管動物中脂質體可以有效幫助寡核苷酸跨膜運輸，但在植物中脂質體卻不容易穿過細胞壁。由于寡核苷酸跨膜運輸的局限性，反義寡核苷酸技術在植物中并未得到廣泛應用。有研究表明，對反義寡核苷酸進行肽核(Peptide nucleic acid, PNA)化學修飾后不需要轉染或電擊就可以直接進入人類或大鼠細胞(Fabani M, Gait MJ (2008)miR-122 targeting with LNA/2’ -0-methyl oligonucleotide mixmers, PNA andPNA-peptide conjugates. RNA 14, 336-346),但其他化學修飾的反義miRNA寡核苷酸可以直接跨植物細胞膜運輸的研究尚未見報道。曾有報道利用蔗糖-寡核苷酸溶液將未加修飾的18-mer反義ODN運輸進大麥的離體葉片或花序，以抑制目標基因的mRNA表達(Sun C，Hoglund AS, Olsson H, Mangelsen E, Jansson C (2005). Antisenseoligodeoxynucleotide inhibition as a potent strategy in plant biology:identification of SUSIBA2 as a transcriptional activator in plant sugarsignalling. Plant Journal 44:128-38 ;Sun C, Ridderstrale K, Hoglund AS, LarssonLG, Jansson C. (2007) Sweet delivery - sugar translocators as ports of entryfor antisense oligodeoxynucleotides in plant cells. Plant Journal 52:1192-8·)。最近，我們提出通過蔗糖介導AMO快速抑制水稻內源活性，主要是利用蔗糖轉運蛋白主動運輸AMO進入植物細胞，達到沉默miRNA的效果。但是，蔗糖介導AMO進入擬南芥細胞會造成擬南芥的干旱脅迫，應用受到限制。目前，利用AMO在擬南芥活體內沉默內源miRNA的研究尚未見有其他報道。
技術實現思路
目前擬南芥miRNA功能研究受限于以人工microRNA或靶基因表達載體構建為基礎的技術，存在實驗周期長、費時費力。最近，我們提出通過蔗糖介導AMO快速抑制水稻內源活性，主要是利用蔗糖轉運蛋白主動運輸AMO進入植物細胞(Sun C，Hoglund AS, Olsson H, Mangelsen E, JanssonC (2005). Antisense oligodeoxynucleotide inhibition as a potent strategy inplant biology: identification of SUSIBA2 as a transcriptional activator in plant sugar signalling. Plant Journal 44:128-38 ;Sun C, Ridderstrale K, HoglundAS, Larsson LG, Jansson C. (2007) Sweet delivery - sugar translocators as portsof entry for antisense oligodeoxynucleotides in plant cells. Plant Journal52:1192-8.)，達到沉默miRNA的效果。但是蔗糖溶液的AMO在處理擬南芥時，會造成植株的干旱脅迫，影響植株正常生長，因此應用受到限制。本專利技術提供了一種利用反義寡核酸沉默擬南芥內源miRNA的方法，可以很好地解決上述問題。，是用miRNA反義寡核苷酸的水溶液浸泡擬南芥根系，使miRNA反義寡核苷酸導入植物細胞。具體步驟為一、根據目標miRNA成熟體序列設計并合成反義寡核苷酸；二、利用核苷酸水溶液浸泡擬南芥根系，將核苷酸導入植物細胞，實現在活體內特異地沉默目標miRNA的顯著效果；所述的核苷酸為目標miRNA的反義寡核苷酸。其中的反義寡核苷酸是采用2’ -Ο-methyl修飾并與miRNA成熟體序列完全互補的反義寡核苷酸。所用擬南芥植株可以是植物活體的幼苗或成體，寡核苷酸溶液浸泡可采用一次浸泡或者間歇多次浸泡的方式。每次浸泡時間為24小時,使用的寡核苷酸溶液中核苷酸的濃度為2. 5 μ M，若多次浸泡則每兩次浸泡之間的間隔期為1-3天，間歇期間擬南芥植株正常培養生長；多次浸泡次數可以為2次或以上。在沉默miR169家族的miRNA，反義寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，對該家族的miRNA都有很好的沉默效果，如ath-miR169h-n(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)和/或ath_miR169c (核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示)。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用反義寡核苷酸沉默擬南芥內源miRNA的方法，其特征在于是用miRNA反義寡核苷酸的水溶液浸泡擬南芥根系，使miRNA反義寡核苷酸導入植物細胞。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：唐恬，謝睦南，施蘇華，吳仲義，張添元，
申請(專利權)人：中山大學，
類型：發明
國別省市：
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