本發明專利技術提供一種含有穿膜肽的提高玉米轉基因效率的轉化體系及方法；所述的轉化體系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的質量比為1:1-3。該轉化方法的步驟為選取自交授粉后的玉米的果穗的苞葉和花絲，將所述的轉化體系滴在切口凹陷處。本發明專利技術在線性DNA或質粒DNA溶液中添加的穿膜肽，利用穿膜肽的特性將提高外源DNA片段整合到受體玉米基因組中的效率；本發明專利技術操作簡便，無需昂貴儀器，生產成本低廉。本發明專利技術不受玉米基因型（自交系品種）和轉化基因種類的限制，所以適用范圍廣泛；本發明專利技術采用線性DNA方法直接將外源基因導入玉米基因組，可去除質粒DNA骨架系列、特別是抗生素基因進入植物基因組，培育的轉基因植物更安全，具有更好的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于植物轉基因領域，具體涉及；所述的轉化 體系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的質量比為1:1-3。該轉化方法的步驟為選取自交授粉后的玉米的果穗的苞葉和花絲，將所述的轉化體系滴在切口凹陷處。
技術介紹
在玉米的轉基因方法研究中，已經報道了多種可行方法可以將外源基因導入玉米中并得以穩定遺傳，這些方法包括基因槍法，PEG介導法，電激法，農桿菌介導法和花粉管通道法。在這些轉化方法中大多依賴于玉米的組織培養技術，玉米的組織培養受基因型和受體范圍的限制比較大，而花粉管通道轉化法不依賴于植物的組織培養技術，無需昂貴的儀器設備，不受自交系品種和轉化基因類型的限制，以及可進行規模化轉化等優點，因此備受人們的青睞。花粉管通道轉化法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿著花粉管滲入，經過珠心通道進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞。周光宇(1979)認為可以利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道(花粉管引導組織)，經珠心通道將外源DNA攜帶進入胚囊，轉化受體為受精卵或其前后的生殖細胞(精子或卵子)，由于它們仍處于未形成細胞壁的類似“原生質體”狀態，并且正進行活躍的DNA復制、分離和重組，所以很容易將外源DNA片段整合到受體基因組中，以達到遺傳轉化的目的(《遠緣雜交的分子基礎-DNA片段雜交假說的一個論證》遺傳學報，1979，6 (4) :405_413)。但目前玉米花粉管通道法還存在轉化效率較低的問題，轉化率為O. 36%-5. 2%不等(關淑艷，張健華，柴曉杰，馬義勇，曲同寶，孫波，王丕武；《花粉管通道法將淀粉分支酶基因反義表達載體轉入玉米自交系的研究》；玉米科學，2005，13 (4) 13-15),(王罡，張艷貞，魏松紅，胡應剛，吳穎，季靜；《花粉管通道法將Bt毒蛋白基因導入優良玉米自交系》；吉林農業大學學報，2002，24 (4):40-44)。細胞膜是生物大分子進出細胞的天然屏障，蛋白及核酸等生物大分子不能夠自由進入細胞。細胞穿膜肽(cell-penetrating peptides簡稱CPPs)是一類能夠攜帶超出自身100倍的大分子物質包括蛋白質及核酸進入細胞的短肽，他們進入細胞的機制可能是利用短肽本身的帶電特性而不依賴于胞吞作用(Chugh A. ,Eudes F. and Shim Y-S.Ce11-penetrating peptides:nanocarrier for macromolecule delivery in livingcells. IUBMB Life, 2010, 62 (3) : 183 - 193, )0近年來細胞穿膜肽用于動物細胞藥物運輸的研究成為熱點，人們也開始利用穿膜肽在植物細胞中轉運生物大分子的研究，發現它具有在動物細胞相似的功能，并且穿膜肽與DNA結合后具有保護DNA完整性防止DNA酶降角軍的功倉泛(Chugh A. , Amundsen E. and Eudes F. Translocation of cell-penetratingpeptides and delivery of their cargoes in triticale microspores. Plant Cell Rep.(2009)28:801 - 810)。因此，在農業科研及生產中需要一種將細胞穿膜肽的特征與花粉管通道轉化法相結合，轉化效率高、操作簡便、能將外源基因直接轉入玉米的提高花粉管的轉化體系及其轉化方法。
技術實現思路
本專利技術提供；所述的轉化體系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的質量比為1:1-3。該轉化方法的步驟為選取自交授粉后的玉米的果穗的苞葉和花絲，將所述的轉化體系滴在切口凹陷處。本專利技術的轉化效率明顯提高。本專利技術的目的是由以下技術方案實現的—種含有穿膜肽的提高玉米轉基因效率的轉化體系，所述的轉化體系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的質量比為1:1-3。進一步地，所述的穿膜肽的氨基酸序列為 Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg，如序列表中SEQ ID No 1所示。進一步地，所述的外源DNA為線性DNA、質粒DNA中的一種。進一步地，所述的質粒DNA為PGM-35SBar質粒載體；所述的線性DNA為通過PCR方法從PGM-35SBar質粒擴增去除骨架，核苷酸序列為序列表中如序列表中SEQ ID No :2所/Jn ο進一步地,所述的質粒載體PGM_35SBar的構建方法包括以下步驟A、將基因35Sbar連接到PGreen0229質粒載體，得到35Sbar_PGreen0229質粒載體；B、將基因Nos連接到所述的35Sbar_PGreen0229質粒載體，得到Nos-35Sbar-PGreen0229 質粒載體；C、將基因UBQI連接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229質粒載體，得到UBQI-Nos-35Sbar-PGreen0229質粒載體，即為所述的質粒載體PGM_35SBar。本專利技術的目的是由以下另一技術方案實現的一種含有穿膜肽的提高玉米轉基因效率的轉化體系，所述的轉化體系中，含有外源DNA、穿膜肽、Silwet L-77 ;所述的外源DNA和穿膜肽的質量比為1:1-3，所述的SilwetL-77占所述的轉化體系的體積比為O. 01%-0. 05%。本專利技術的目的是由以下又一技術方案實現的一種含有穿膜肽的提高玉米轉基因效率的轉化方法，所述的轉化體系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的質量比為1:1-3 ;所述的轉化方法的步驟為選取自交授粉后的玉米的果穗，剪去苞葉和花絲，將所述的轉化體系滴在切口凹陷處。本專利技術與現有技術相比具有以下有益效果I、因為本專利技術在線性DNA或質粒DNA溶液中添加的穿膜肽，利用穿膜肽的特性將外源DNA順利帶進受精細胞，并進入細胞核，因此大大提高外源DNA片段整合到受體玉米基因組中的效率。2、因為本專利技術直接將含有目的基因的線性DNA或質粒DNA溶液轉入玉米中，不依賴于玉米的組培再生體系，所以操作簡便，無需昂貴儀器，生產成本低廉。3、因為本專利技術不受玉米基因型(自交系品種)和轉化基因種類的限制，所以適用范圍廣泛。4、因為本專利技術采用線性DNA方法直接將外源基因導入玉米基因組，可以去除質粒DNA骨架系列、特別是抗生素基因進入植物基因組，所以培育的轉基因植物更加安全，具有更好的應用前景。附圖說明圖I為實施例2中的質粒載體PGM_35SBar結構示意圖。圖2為實施例2的高抗除草劑的抗性植株的PCR擴增反應檢測結果電泳圖。圖3為實施例2的Tl代轉基因植株噴施除草劑7天后的照片。 具體實施例方式實施例I :一種含有穿膜肽的提高玉米轉基因效率的轉化體系，所述的轉化體系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的質量比為1:1-3。所述的穿膜肽的氨基酸序列如序列表中SEQ No 1所示。所述的外源DNA為線性DNA、質粒DNA中的一種。所述的線性DNA的核苷酸序列如序列表中SEQ No :2所示；所述的質粒DNA為質粒載體 PGM-35SBar。一本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種含有穿膜肽的提高玉米轉基因效率的轉化體系，其特征在于：所述的轉化體系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的質量比為1:1？3。
【技術特征摘要】
1.一種含有穿膜肽的提高玉米轉基因效率的轉化體系，其特征在于所述的轉化體系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的質量比為1:1-3。2.根據權利要求I所述的含有穿膜肽的提高玉米轉基因效率的轉化體系，其特征在于所述的穿膜肽的氨基酸序如序列表中SEQ ID No 1所示。3.根據權利要求I或2所述的含有穿膜肽的提高玉米轉基因效率的轉化體系，其特征在于所述的外源DNA為線性DNA、質粒DNA中的一種。4.根據權利要求3所述的含有穿膜肽的提高玉米轉基因效率的轉化體系，其特征在于所述的線性DNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No :2所示，所述的質粒DNA為質粒載體 PGM-35SBar。5.根據權利要求4所述的含有穿膜肽的提高玉米轉基因效率的轉化體系，其特征在于所述的質粒載體PGM-35SBar的構建方法包括以下步驟 A、將基因35Sbar連接到PGreen0229質粒載體，得到35Sbar_PGreen0229質粒載體； B、將基因Nos連接到所述的35Sbar-PGreen0229質粒載體，得到Nos-35Sbar-PGreen0229 質粒載體； C、將基因UBQI連接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229質粒載體，得到UBQI...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳忠義，黃叢林，張秀海，羅昌，程曦，梁宏霞，李春華，翟亦倩，
申請(專利權)人：北京農業生物技術研究中心，
類型：發明
國別省市：
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