一種寡核苷酸染液及其應用與用法制造技術

本發明專利技術屬于細胞生物學和分子生物學研究領域，具體涉及一種寡核苷酸染液及其應用與用法。所述寡核苷酸染液包括YMPNS?CentC69?1、MKnob?2、YMPNS?MR68?3、(ACT)10?4個經過修飾的寡核苷酸探針，按一定比例混合并由2×SSC稀釋而成。所述寡核苷酸染液在每張不經變性的染色體制片上加8μl，并加入2.5μl?50％w/v硫酸葡聚糖于37℃培養箱進行雜交2小時，然后在42℃2×SSC中洗5分鐘，用DAPI套染后即可在熒光顯微鏡下進行觀察。所述寡核苷酸染液可以開發成商品用于玉米及其親緣物種的染色體快速鑒定。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于細胞生物學和分子生物學研究領域，具體涉及一種寡核苷酸染液及其應用與用法。
技術介紹
寡核苷酸是可人工合成的短DNA或RNA序列。寡核苷酸作為探針廣泛應用于染色體鑒定。由于單鏈寡核苷酸(single-strandoligonucleotide，SSON)探針具有較高的敏感性和分辨率，已在小麥、黑麥等多個作物以及人類的染色體鑒定中得到應用(Fuetal.2015，Duetal.2016，Beliveauetal.2012)。SSON探針的特點是易于合成和標記檢測信號，可避免常規熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)過程中的變性步驟。該方法通常稱為非變性熒光原位雜交(non-denaturingFISH，ND-FISH)。隨著基因組測序的發展，SSON探針的開發已由基于端粒重復序列和簡單重復序列(simplesequencerepeat，SSR)發展到基于基因組序列和串聯重復序列(Hanetal.2015，Tangetal.2014)。由于SSON探針的雜交信號與基于常規質粒克隆開發的探針的雜交信號一樣穩定，因此，SSON可以取代質粒克隆用于開發FISH的簡化步驟。所以開發一種能夠全面鑒定物種染色體的SSON探針組具有重要的意義。
技術實現思路
本專利技術的目的是解決現有單一探針組成的染液不能全面鑒定物種染色體的問題，提供能夠全面鑒定物種染色體的寡核苷酸染液及其用法與應用。為了實現上述目的，本專利技術采用的技術方案是：一種寡核苷酸染液，所述染液包含四個寡核苷酸探針：第一個寡核苷酸探針為YMPNS-CentC69-1，5′端由FAM修飾，其核苷酸序列為：5′-CCCAATCCACTACTTTAGGTCCAAAACTCATGTTTGGGGTGGTTTCGCGCAATTTCGTT-3′；第二個寡核苷酸探針為MKnob-2，5′端由FAM修飾，其核苷酸序列為：5′-GAAGGCTAACACCTACGGATTTTTGACCAAGAAATGGTCTCCACCAGAAATCCAAAAAT-3′；第三個寡核苷酸探針為YMPNS-MR68-3，5′端由TAMRA修飾，其核苷酸序列為：5′-CTCTCGTGCGAATACAATGCCCTCAATATCATAGAAACACTATTCCTTTAGTGTGAATA-3′；第四個寡核苷酸探針為(ACT)10，5′端由TAMRA修飾，其核苷酸序列為：5′-ACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACT-3′。優選的，所述寡核苷酸染液包括YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3、(ACT)10和2×SSC，其中YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3、(ACT)10四種探針組成探針混合液，所述染液按體積比計，探針混合液︰2×SSC＝22︰25；所述探針混合液由體積比YMPNS-CentC69-1:MKnob-2:YMPNS-MR68-3:(ACT)10＝20:4:15:5混合所得，其中YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3、(ACT)10混合前均為1.0μg/μl的水溶液。根據本專利技術的另一個方面，本專利技術所述的寡核苷酸染液可用于玉米及其親緣物種中染色體快速鑒定；根據本專利技術的又一個方面，本專利技術提供了一種寡核苷酸染液快速鑒定玉米染色體的用法：將寡核苷酸染液加8μl在每張不經變性的染色體制片上，并加入2.5μl50％w/v硫酸葡聚糖水溶液于37℃培養箱進行雜交2小時，然后在42℃2×SSC中洗5分鐘，用DAPI套染后在熒光顯微鏡下進行觀察。根據本專利技術的又一個方面，本專利技術所述的寡核苷酸染液可用于制備商品化染液，優選為試劑盒及其由試劑盒衍生的其它商品。本專利技術與現有技術相比具有如下優點：本專利技術成本低、檢測時間快，可用于大規模玉米染色體變異分析。本專利技術中的探針名稱YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3和(ACT)10均為本專利技術自己定義的名稱。附圖說明：圖1為16個玉米材料的多重SSON探針核型分析。具體實施方式為使本專利技術的目的、技術方案和優點更加清楚明了，下面結合具體實施方式，對本專利技術進一步詳細說明。應該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本專利技術的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試劑耗材，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的，另外實驗過程中如無特殊說明，所述溶液均為水溶液。實施例1、植物材料及染色體準備共有16個玉米材料用于染色體分析，包括3個自交系及對應的2個雜交種，以及其它11個中國主栽雜交種(表1)。玉米種子浸在水中28℃培養過夜直至根尖長度達到2cm。切取根尖放入2ml離心管，用0.29g/L8-羥基喹啉溶液處理3～4h。然后使用體積比為3:1的乙醇冰醋酸溶液固定2-3天。進行染色體準備時，切取0.3-0.5mm的根尖組織加入45％(v/v)的冰醋酸溶液進行滴片，-70℃冷凍過夜。含有有絲分裂染色體的載玻片經100％乙醇脫水后用于FISH或ND-FISH分析。表1所用材料2、單鏈寡核苷酸(SSON)探針開發及標記利用簡單序列重復(SSR)及質粒克隆的串聯重復序列開發SSON探針。SSR包括(A)35，(GA)15，(AT)15，(GC)15，(AC)15，(GCC)10，(ACG)10，(CAG)10，(ATT)10，(AGG)10，(CAC)10，(CAT)10，(ACT)5，(ACT)10，(ACT)19，(GAA)10以及(AAC)10(CuadradoandJouve2010)。串聯重復序列包括180bpKnob序列，第六染色體特異序列MR68，Knob關聯成簇重復TR1-357，著絲粒重復CentC69以及Knob關聯串聯重復克隆K10-72(Peacocketal.1981；Chenetal.2000，Hsuetal.2003，NCBI數據庫http://preview.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)(表2)。基于SSR及180bpKnob序列合成的SSON探針在其5’末端由TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明)或FAM(6-羧基熒光素)直接修飾，其它基于質粒克隆開發的SSON探針由生物素或地高辛標記。表2具有雜交信號的SSON探針3、非變性熒光原位雜交每個不經變性的染色體載玻片含有12μl的雜交液，由5.0μl20×SSC緩沖液，2.5μl50％(w/v)硫酸葡聚糖以及5～3000ngSSON(根據每個SSON探針調節)，上覆20×20mm蓋玻片。混合好的染液在37℃培養箱雜交2小時，然后在42℃2×SSC中洗5分鐘，用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)套染后在奧林巴斯BX51熒光顯微鏡下進行觀察，染色體無重疊，雜交信號清晰的圖片用于后續分析。每個載玻片觀察5-20個細胞，每個玉米材料至少檢測4個重復。4、非變性熒光原位雜交分析非變性熒光原位雜交結果顯示：基于SSR開發的SSON探針中，(ACT)10在B73的3個染色體(1、2和4)及Mo17的四個染色體(1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種寡核苷酸染液，所述染液包含四個寡核苷酸探針：第一個寡核苷酸探針為YMPNS?CentC69?1，5′端由FAM修飾，其核苷酸序列為：5′?CCCAATCCACTACTTTAGGTCCAAAACTCATGTTTGGGGTGGTTTCGCGCAATTTCGTT?3′；第二個寡核苷酸探針為MKnob?2，5′端由FAM修飾，其核苷酸序列為：5′?GAAGGCTAACACCTACGGATTTTTGACCAAGAAATGGTCTCCACCAGAAATCCAAAAAT?3′；第三個寡核苷酸探針為YMPNS?MR68?3，5′端由TAMRA修飾，其核苷酸序列為：5′?CTCTCGTGCGAATACAATGCCCTCAATATCATAGAAACACTATTCCTTTAGTGTGAATA?3′；第四個寡核苷酸探針為(ACT)10，5′端由TAMRA修飾，其核苷酸序列為：5′?ACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACT?3′。

【技術特征摘要】
1.一種寡核苷酸染液，所述染液包含四個寡核苷酸探針：第一個寡核苷酸探針為YMPNS-CentC69-1，5′端由FAM修飾，其核苷酸序列為：5′-CCCAATCCACTACTTTAGGTCCAAAACTCATGTTTGGGGTGGTTTCGCGCAATTTCGTT-3′；第二個寡核苷酸探針為MKnob-2，5′端由FAM修飾，其核苷酸序列為：5′-GAAGGCTAACACCTACGGATTTTTGACCAAGAAATGGTCTCCACCAGAAATCCAAAAAT-3′；第三個寡核苷酸探針為YMPNS-MR68-3，5′端由TAMRA修飾，其核苷酸序列為：5′-CTCTCGTGCGAATACAATGCCCTCAATATCATAGAAACACTATTCCTTTAGTGTGAATA-3′；第四個寡核苷酸探針為(ACT)10，5′端由TAMRA修飾，其核苷酸序列為：5′-ACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACT-3′。2.根據權利要求1所述的寡核苷酸染液，其特征在于：所述寡核苷酸染液包括YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3、(ACT)10和2×SSC，其中YMP...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張體付，趙涵，亓增軍，
申請(專利權)人：江蘇省農業科學院，
類型：發明
國別省市：江蘇;32