雙鏈核酸的合成制造技術

本發(fā)明專利技術涉及用于從多種樣品合成雙鏈核酸的方法并且包括這些核酸用于深度序列分析的用途。另外，本發(fā)明專利技術涉及用于本發(fā)明專利技術方法的特定試劑。此外，本發(fā)明專利技術涉及包含用于本發(fā)明專利技術方法的試劑的試劑盒和所述試劑盒的用途。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】本專利技術涉及用于從多種樣品合成雙鏈核酸的方法并且包括這些核酸用于深度序列分析的用途。另外，本專利技術涉及用于本專利技術的方法中的特定試劑。此外，本專利技術涉及包含用于本專利技術的方法之試劑的試劑盒和所述試劑盒的用途。專利技術背景核酸的大規(guī)模平行測序(Massiveparallelsequencing，MPS)需要制備擴增文庫，其中待測序的DNA區(qū)域位于已知的5’-和3’-末端序列之間。用于MPS文庫構建的當前方法利用RNA或DNA接頭(adaptor)連接到RNA或DNA樣品的5’和3’末端。接頭的連接不僅耗時，而且是需要以微克級輸入(micrograminputs)核酸樣品的低效率過程。此外，所得cDNA文庫受到接頭交叉和自我連接副產物污染，并且在預擴增之前和之后需要額外的純化步驟。十多年前，Clontech實驗室描述了利用莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(MMLV-RT)的模板轉換活性選擇地將接頭連接至由聚(A)加尾的mRNA分子產生cDNA的5’-末端的方法。同時，將3’-接頭序列并入聚(dT)逆轉錄引物中。這種稱為SMART的原理目前用于IlluminaUltraLowRNA測序試劑盒(Clontech)中以從單個細胞產生mRNA分子的全長cDNA拷貝。然而，該方法仍然需要在模板合成后進行：(1)擴增的cDNA的片段化，(2)平臺特異性5’/3’-端接頭的連接和(3)接頭連接的DNA片段的預擴增。雖然SMART方法能夠從單細胞量的RNA制備用于測序的cDNA，但是其耗時、昂貴并且限于mRNA測序。到目前為止，使用MMLV-RT的模板轉換活性的方法還沒有應用于對(1)除長RNA之外的RNA分子和(2)任何DNA分子進行測序。本專利技術描述了在僅幾小時的時間范圍內從皮克(pg)量的RNA或DNA分子產生即時可測序的雙鏈或單鏈DNA，優(yōu)選DNA文庫的方法。小的(＜150bp)RNA或DNA(例如miRNA(微小RNA)、piRNA(piwiRNA)、降解的或亞硫酸氫鹽轉化的DNA)可直接用作輸入。然而，長的RNA或DNA必須首先通過相應的方法(例如，對于DNA進行超聲處理或對于RNA進行Mg2+孵育)片段化。本專利技術的方法提供了若干優(yōu)點，其包括明顯降低提供即時可測序DNA(其可基于DNA或RNA)所需的時間，所述方法與任何現(xiàn)有技術方法相比，明顯成本更低。目前用于RNA和DNA的新一代測序之cDNA文庫制備的商業(yè)試劑盒，根據應用、試劑盒類型和供應商品牌，樣品定價在200至500美元之間。使用本專利技術的方法進行單個DNA文庫制備所需的成本的粗略估計至少低20倍，并且本專利技術的方法將允許對來自由于可從樣品獲得最小量的DNA和/或RNA之前不可能測序來源的核酸進行測序。那些樣品的實例包括：來自小(診斷)量的液體和固體活檢樣品的DNA和RNA、細胞的靶區(qū)室(例如，微核、內質網)、化石、滅絕生物體的殘余物和含有微小和高度片段化的DNA分子的法醫(yī)學樣品。本專利技術在一定程度上基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即DNA也可作為逆轉錄酶的底物。
技術實現(xiàn)思路
在第一方面，本專利技術提供了用于從包含單鏈核酸的樣品合成具有限定的3’和5’端核苷酸序列的雙鏈核酸的方法，所述方法包括以下步驟：a)提供包含單鏈核酸或雙鏈核酸的樣品，任選地使所述雙鏈核酸變性；b)向單鏈核酸或雙鏈核酸的3’-端添加至少5個，優(yōu)選10至50個連續(xù)的核苷酸，c)使與所添加核苷酸序列互補的引發(fā)寡核苷酸雜交并用模板依賴性DNA或RNA聚合酶合成cDNA或cRNA以產生雙鏈核酸，d)使模板轉換寡核苷酸(TSO)與所述雙鏈核酸雜交，以及e)使cDNA或cRNA鏈的3’末端延伸以合成雙鏈核酸，其中所述核酸的一條鏈包含所述引發(fā)寡核苷酸以及與所述單鏈核酸和所述模板轉換寡核苷酸互補的cDNA或cRNA。在第二方面，本專利技術提供了包含以下序列元件的引發(fā)寡核苷酸：3’-Wm-X-Yn-Z1o-Qt-Z2s-5’，其中W在每種情況下獨立地選自：dA、dG、dC、dT和dU；X選自：dA、dG、dC、dT、dU、rA、rG、rC、rT和rU；Y是至少10個核苷酸長度的多核苷酸，其中所述序列的80％或更多由選自以下的相同的核苷酸或二核苷酸構成：dA、dG、dC、dT、dU、rA、rG、rC、rT、rU、AC、AG、AT、AU、CA、CG、CT、CU、GA、GC、GT、GU、TA、TC、TG、TU、AA、CC、GG、TT、UU、UA、UC、UG和UT，其中所述序列的另外至多20％或更少由不同于主要核苷酸或二核苷酸并且也選自以下的核苷酸或二核苷酸構成：dA、dG、dC、dT、dU、rA、rG、rC、rT、rU、AC、AG、AT、AU、CA、CG、CT、CU、GA、GC、GT、GU、TA、TC、TG、TU、AA、CC、GG、TT、UU、UA、UC、UG和/或UT，前提條件是X不同于構成Y大部分的核苷酸或二核苷酸；Q是連續(xù)的簡并(擺動)DNA堿基的序列，優(yōu)選地選自：N、V、H、D、B和J，其中N是并入來自dA、dT、dC和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物；B是并入來自dT、dC和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物；D是并入來自dA、dT和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物；H是并入來自dA、dT和dC等摩爾混合物的核苷酸的產物；V是并入來自dA、dC和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物，J是并入來自(0-100％dA)比(0-100％dG)比(0-100％dC)比(0-100％dT)比(0-100％dU)比(0-100％rA)比(0-100％rG)比(0-100％rC)比(0-100％rT)比(0-100％rU)的混合物的核苷酸的產物；Z1是限定序列的至少5個核苷酸長度的多核苷酸，其中所述序列不同于Wm-X-Yn，優(yōu)選地所述序列也不同于Qt-Z2s；Z2是限定序列的至少5個核苷酸長度的多核苷酸，其中所述序列不同于Wm-X-Yn-Z1o-Qt；m是0至6的整數，即0、1、2、3、4、5或6；如果Y選自dA、dG、dC、dT、dU、rA、rG、rC、rT和rU，則n是10至100的整數，如果Y選自AC、AG、AT、AU、CA、CG、CT、CU、GA、GC、GT、GU、TA、TC、TG、TU、AA、CC、GG、TT、UU、UA、UC、UG和UT，則n是5至50的整數；o是0或1；s是0或1；并且t是0至6的整數，即0、1、2、3、4、5或6。在第三方面，本專利技術提供了包含以下序列元件的模板轉換寡核苷酸5’-Xp-Y-Qt-Zq-Ar-3’其中X是選自氨基、生物素、甘油、膽固醇、地高辛、氟殘基或核苷酸衍生物的化學基團，所述核苷酸衍生物包括脫堿基核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸、3’-脫氧核苷酸、2’-脫氧肌苷、2’-脫氧尿苷；Y是已知的寡核苷酸序列；Q是連續(xù)的簡并(擺動)DNA堿基的序列，優(yōu)選地選自：N、V、H、D、B和J，其中N是并入來自dA、dT、dC和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物；B是并入來自dT、dC和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物；D是并入來自dA、dT和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物；H是并入來自dA、dT和dC等摩爾混合物的核苷酸的產物；V是并入來自dA、dC和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物，J是并入來自(0-100％dA)比(0-100％dG)比(本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于從包含單鏈核酸的樣品合成具有限定的3’和5’端核苷酸序列的雙鏈核酸的方法，所述方法包括以下步驟：a)提供包含單鏈核酸或雙鏈核酸的樣品，任選地使所述雙鏈核酸變性，b)向所述單鏈核酸或雙鏈核酸的3’?端添加至少5個連續(xù)的核苷酸，c)使與所添加核苷酸序列互補的引發(fā)寡核苷酸雜交并用模板依賴性DNA或RNA聚合酶合成cDNA或cRNA以產生雙鏈核酸，d)使模板轉換寡核苷酸與所述雙鏈核酸雜交，以及e)使所述cDNA或cRNA鏈的3’末端延伸以合成雙鏈核酸，其中所述核酸的一條鏈包含所述引發(fā)寡核苷酸以及與所述單鏈核酸和所述模板轉換寡核苷酸互補的cDNA或cRNA。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.05.14 EP 14168313.61.用于從包含單鏈核酸的樣品合成具有限定的3’和5’端核苷酸序列的雙鏈核酸的方法，所述方法包括以下步驟：a)提供包含單鏈核酸或雙鏈核酸的樣品，任選地使所述雙鏈核酸變性，b)向所述單鏈核酸或雙鏈核酸的3’-端添加至少5個連續(xù)的核苷酸，c)使與所添加核苷酸序列互補的引發(fā)寡核苷酸雜交并用模板依賴性DNA或RNA聚合酶合成cDNA或cRNA以產生雙鏈核酸，d)使模板轉換寡核苷酸與所述雙鏈核酸雜交，以及e)使所述cDNA或cRNA鏈的3’末端延伸以合成雙鏈核酸，其中所述核酸的一條鏈包含所述引發(fā)寡核苷酸以及與所述單鏈核酸和所述模板轉換寡核苷酸互補的cDNA或cRNA。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品是液體或固體活檢樣品或由其來源，更優(yōu)選血液樣品、血漿樣品、血清樣品、體液樣品、唾液樣品、尿樣品、精液樣品、來自胸膜腔的流體樣品、來自腹膜腔的流體樣品、腦脊液的樣品、來自上皮表面的涂片、痰樣品、糞便樣品、射精樣品、淚液樣品、汗液樣品、淋巴液樣品、支氣管灌洗樣品、胸腔積液樣品、腦膜液樣品、腺液樣品、細針抽吸樣品、微切割細胞、乳頭抽吸液樣品、脊髓液樣品、結膜液樣品、陰道液樣品、十二指腸液樣品、胰液樣品或膽汁樣品。3.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品是從化石、滅絕生物體的殘余物、植物、果實和動物、微生物、細菌或病毒獲得的。4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述單鏈核酸是DNA，優(yōu)選片段化的和/或亞硫酸氫鹽轉化的DNA；或者RNA，優(yōu)選miRNA、小RNA、piRNA或亞硫酸氫鹽轉化的RNA。5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述連續(xù)的核苷酸是相同的，或由相同的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸或多核苷酸組成。6.根據權利要求5所述的方法，其中所述連續(xù)的相同核苷酸選自A、T、G、C或U的核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或雙脫氧核糖核苷酸，或者選自兩個或更多個核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸。7.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中多核苷酸加尾反應是用兩個或更多個核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的混合物進行的。8.根據權利要求5或6所述的方法，其中所述相同的核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或雙脫氧核糖核苷酸通過選自以下的酶添加：聚(A)-聚合酶、聚(U)-聚合酶、聚(G)-聚合酶、末端轉移酶、DNA連接酶、RNA連接酶；而二核苷酸和三核苷酸通過RNA連接酶添加。9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述引發(fā)寡核苷酸包含以下核苷酸序列元件：3’-Wm-X-Yn-Z1o-Qt-Z2s-5‘，其中W在每種情況下獨立地選自：dA、dG、dC、dT和dU；X選自：dA、dG、dC、dT、dU、rA、rG、rC、rT和rU；Y是至少10個核苷酸長度的多核苷酸，其中所述序列的80％或更多由選自以下的相同的核苷酸或二核苷酸構成：dA、dG、dC、dT、dU、rA、rG、rC、rT、rU、AC、AG、AT、AU、CA、CG、CT、CU、GA、GC、GT、GU、TA、TC、TG、TU、AA、CC、GG、TT、UU、UA、UC、UG和UT，其中所述序列的另外20％或更少由不同于主要核苷酸或二核苷酸并且也選自以下的核苷酸或二核苷酸構成：dA、dG、dC、dT、dU、rA、rG、rC、rT、rU、AC、AG、AT、AU、CA、CG、CT、CU、GA、GC、GT、GU、TA、TC、TG、TU、AA、CC、GG、TT、UU、UA、UC、UG和/或UT，前提條件是X不同于構成Y大部分的核苷酸或二核苷酸；Q是連續(xù)的簡并(擺動)DNA堿基的序列，優(yōu)選地選自N、V、H、D、B和J，其中N是并入來自dA、dT、dC和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物；B是并入來自dT、dC和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物；D是并入來自dA、dT和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物；H是并入來自dA、dT和dC等摩爾混合物的核苷酸的產物；V是并入來自dA、dC和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物，J是并入來自(0-100％dA)比(0-100％dG)比(0-100％dC)比(0-100％dT)比(0-100％dU)比(0-100％rA)比(0-100％rG)比(0-100％rC)比(0-100％rT)比(0-100％rU)的混合物的核苷酸的產物；Z1是限定序列的至少5個核苷酸長度的多核苷酸，其中所述序列不同于Wm-X-Yn，優(yōu)選所述序列也不同于Qt-Z2s；Z2是限定序列的至少5個核苷酸長度的多核苷酸，其中所述序列不同于Wm-X-Yn-Z1o-Qt；m是0至6的整數，即0、1、2、3、4、5或6；如果Y選自dA、dG、dC、dT、dU、rA、rG、rC、rT和rU，則n是10至100的整數，如果Y選自AC、AG、AT、AU、CA、CG、CT、CU、GA、GC、GT、GU、TA、TC、TG、TU、AA、CC、GG、TT、UU、UA、UC、UG和UT，則n是5至50的整數；o是0或1；s是0或1；并且t是0至6的整數，即0、1、2、3、4、5或6。10.根據權利要求9所述的方法，其中Z1和/或Z2選自：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19和SEQIDNO：20。11.根據權利要求1至10中任一項所述的方法，其中所述模板轉換寡核苷酸由下式表示5’-Xp-Y-Qt-Zq-Ar-3’其中X是選自氨基、生物素、甘油、膽固醇、地高辛、氟殘基或核苷酸衍生物的化學基團，所核苷酸衍生物包括脫堿基核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸、3’-脫氧核苷酸、2’-脫氧肌苷、2’-脫氧尿苷；Y是已知的寡核苷酸序列；Q是連續(xù)的簡并(擺動)DNA堿基的序列，優(yōu)選地選自：N、V、H、D、B和J，其中N是并入來自dA、dT、dC和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物；B是并入來自dT、dC和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物；D是并入來自dA、dT和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物；H是并入來自dA、dT和dC等摩爾混合物的核苷酸的產物；V是并入來自dA、dC和dG等摩爾混合物的核苷酸的產物，J是并入來自(0-100％dA)比(0-100％dG)比(0-100％dC)比(0-100％dT)比(0-100％dU)比(0-100％rA)比(0-100％rG)比(0-100％rC)比(0-100％rT)比(0-100％rU)混合物的核苷酸的產物；Z是選自AMP、CMP、GMP、TMP和UMP的核糖核苷酸，A是選自氨基、生物素、甘油、膽固醇、地高辛、磷酸/鹽/酯、氟殘基或核苷酸衍生物的化學基團，所述核苷酸衍生物包括脫堿基核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸、3’-脫氧核苷酸、2’-脫氧肌苷、2’-脫氧尿苷；t是0至6的整數，即0、1、2、3、4、5或6；p是0至10的整數，即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；q是至少為1的整數；并且r是0至10的整數，即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。12.根據權利要求1至11...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：安德雷·圖爾奇諾維奇，哈拉爾德·蘇羅維，芭芭拉·伯溫克爾，
申請(專利權)人：海德堡魯普雷希特卡爾斯大學，德國癌癥研究公共權益基金會，
類型：發(fā)明
國別省市：德國;DE