一種抗豬瘟病毒的肽核酸制造技術

本發明專利技術提供了一種抗豬瘟病毒的肽核酸，所說的肽核酸為針對抗豬瘟病毒的C蛋白和/或Npro蛋白的反義核酸序列。本發明專利技術還提供了含有所述的抗豬瘟病毒的肽核酸的藥物組合物。本發明專利技術還提供了所述的抗豬瘟病毒在制備動物藥物上的用途。本發明專利技術的用于防控豬瘟病毒CSFV的特異性抗病毒肽核酸動物藥物，是針對CSFVC和Npro的基因保守部分設計高效特異性的反義核酸序列，并采用特定工藝人工合成肽核酸片段，該序列與上述保守性靶基因互補，根據堿基互補原理，反義核酸序列特異性地與CSFVC和Npro的對應的靶基因相結合，誘導核酶對靶基因進行降解，從而阻斷靶基因的轉錄與表達，抑制CSFV在機體內復制與裝配，以達到防控豬瘟的目的。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術的目的是克服現有技術的不足之處，提供一種抗豬瘟病毒的肽核酸。
技術介紹
豬痕(HogCholera, HC),又稱之為經典豬痕(Classical Swine Fever, CSF),不同于非洲豬瘟，系由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病。豬瘟最早于19世紀30年代在美國的俄亥俄州發現，是一種接觸性傳染，流行廣、死亡率高的豬的傳染病。豬瘟造成的經濟損失巨大，歷來是各國研究的熱點，國際獸醫局(OIE)國際委員會將豬瘟列入A類16種法定傳染病之一。 我國是世界上養豬最多的國家，也是豬瘟流行嚴重的國家之一，我國近幾年因各種疾病死亡的豬占飼養總數的8% 10%，其中1/3以上由豬瘟致死，每年的直接經濟損失數十億元，造成了巨大的人力和資源浪費。間接影響如豬群中存在豬瘟時主要國際市場都禁止進口其活豬和豬肉。根據發病的程度，將其分為急性、亞急性、慢性、非典型性和不明顯型。急性CSF由強毒株引發，一般導致高發病率和死亡率，而弱毒病毒感染則無明顯臨床癥狀。介于疫苗的廣泛應用，有效地控制了豬瘟的大流行，減少了急性死亡。但自上世紀70年代末以來，全世界豬瘟流行的特點均發生了重大變化，如臨床癥狀不典型，病程變長，呈周期性、波浪形的地區散發性流行，持續感染普遍存在，疫苗的預防效果明顯下降。同時疫點明顯減少，多局限于所謂的“豬瘟的不穩定地區”的散發性流行。近年來，國內又出現豬瘟的反彈現象，而且疫情變得異常復雜，如既有區域性大流行又有零散式發生，既有高死亡率的急性癥狀，又有頑固的持續發生的溫和性癥狀。目前世界各國針對CSF疫情的處理主要有兩種手段:1，撲殺，建立完善且嚴格的疫情監測與報告體系，及時發現、劃定及封鎖疫區、采取徹底撲殺所有感染豬群與感染動物并進行無害化處理和徹底消毒環境，消滅傳染源；2，免疫，強化以豬瘟病毒(CSFV)疫苗接種為主要手段。中國豬瘟兔化弱毒(C2株)疫苗自從問世以來，一直享譽海內外，被許多國家竟相引用。自從二十世紀60年代以來，C2株疫苗及其換代產品(細胞苗)在我國以防為主的豬瘟防治策略的實施中起到了決定性的作用，有效地控制了豬瘟在我國的急性發生和大流行。但自20世紀80年代以來，非典型性豬瘟成為該病的主要發生形式，持續感染普遍存在，疫苗的預防效果明顯下降，使豬瘟防制遇到了新的困難。經流行病學調研發現近年來豬瘟流行毒已呈遠向疫苗毒的方向演變，近期豬瘟流行毒與古典豬瘟毒之間有較大差異(核酸和氨基酸同源性分別為82.2% 84.3%和87.9% 90.4%)。豬痕病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae)痕病毒屬。病毒顆粒呈圓形,直徑為40 -50 nm,有囊膜,病毒表面有6 nm 8 nm類似穗樣的突起，內部為二十面體的對稱核衣殼，內部核心直徑大約30 nm，豬瘟病毒不耐熱，pH5 10時穩定，不耐酸(如<pH3.0)，對乙醚、氯仿和去氧膽酸鹽等脂溶劑敏感，可很快使病毒失活。參考豬瘟流行毒株的序列，該病毒可分為三個群=CSFV-1,稱為古典豬瘟，以Brescia株為代表。CSFV-2，以Alfort株為代表。CSFV-3，與上述二個群均有較大差異，包括了一些日本、泰國和臺灣地區近年來流行毒株。中國流行的優勢毒株多屬CSFV-2。CSFV基因組為單股線性正鏈RNA分子，基因組大約12.5 kb,由5’非編碼區(5’ -UTR)、一個開放閱讀框(ORF)和3’-非編碼區(3’-UTR)構成。其5'端無甲基化帽子結構，3'端也無poly (A)尾巴結構。5'端UTR長度為373 nt或374 nt，有莖環，發夾等復雜二級結構，其5'端沒有帽子結構，因而翻譯起始機制與一般真核生物的mRNA分子不同，是由5'端UTR內有一個稱為核糖體內部進入位點(Internal Ribosome Entry Site, IRES)的結構元件與核糖體40S亞基結合，啟動蛋白質的翻譯。5'端UTR不僅與翻譯有關，與病毒基因組的復制也有關。3’端長度215 nt 239 nt，隨毒株不同而有差異。在所有瘟病毒中3'端是高度保守的，特別是最后大約100 nt的區域。3'端在病毒的復制繁殖過程中有重要作用，它參與病毒基因組的復制、多聚蛋白的翻譯和病毒粒子的裝配。中間的ORF編碼一個3898個氨基酸的多聚蛋白，分子量約438 kDa的多聚蛋白(NpM、C、Ems (E0),EUE2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)，并進一步在病毒和宿主細胞蛋白酶的作用下加工為成熟蛋白，CSFV的所有結構蛋白和非結構蛋白均由該ORF所編碼。蛋白及其功能 C蛋白為豬瘟病毒的核衣殼蛋白，為結構蛋白，由86 89個氨基酸殘基組成，分子質量14 kDa，又被稱之為pl4，該蛋白的N端為Serl9。C蛋白富含堿性氨基酸(賴氨酸和精氨酸)，帶正電荷。C蛋白除構成病毒的核衣殼外，同時在病毒增殖過程中對基因表達調控發揮著重要的作用。研究表明，該蛋白179 180、194 198、208 212氨基酸的突變將顯著降低病毒的增殖能力。C蛋白主要分布在細胞核和細胞漿中，這可能與C蛋白參與病毒復制和轉錄調控有關，但其具體作用機制還需深入研究。另有研究表明，重組表達的C蛋白可激活人HSP70基因的啟動子，但對SV40啟動子具有抑制作用，這也證明了 C蛋白對基因表達有調節作用，而且對不同的啟動子有截然相反的調控作用。pro蛋白及其功能 Npro蛋白，也稱p23，為豬瘟病毒編碼的非結構蛋白，分子量為23kDa，處于ORF編碼的多聚蛋白N端的第一位，由168個氨基酸殘基組成，是一種具有蛋白水解酶活性的半胱氨酸蛋白酶，其具有在自身C端剪切產生病毒核衣殼蛋白的N端的功能，是病毒在細胞內增殖所必需的構件，當它缺失后，從培養物中分離不到存活的病毒。研究表明Npix)有助于CSFV逃避機體的自然免疫，建立持續性感染。Xu等通過基因沉默技術，干擾Npix)表達可有效抑制CSFV在PK-15細胞中的繁殖。Wen等以家兔為模型，發現家兔感染CSFV后，干擾Npro表達同樣可以能有效抑制豬瘟病毒的增殖。Ruggli等研究表明，Npix)能抑制機體的天然免疫系統，使病毒逃避宿主的免疫清除，因此，Npro實可能與豬瘟病毒的毒力及致病性有關。反義核酸(antisense nucleic acid)是一段與革E基因(mRNA或DNA)的某段序列互補的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反義核酸通過堿基配對方式特異性的與病毒靶基因結合形成雜交分子，從而在復制、轉錄和翻譯水平調節靶基因的表達，或誘導RNase H識別并切割mRNA，進而使其功能喪失。反義核酸包括反義RNA (antisense RNA)和反義DNA (antisense DNA),具有合成方便、序列設計簡單、容易修飾、選擇性高、親和力強等特點。反義核酸作為一種新的抗病毒、抗腫瘤藥物，掀起了一場藥理學領域的革命，即新的藥物受體mRNA通過新受體結合方式(Watson-Crick雜交)、引發新的藥物受體結合后反應:(I) RNase H介導的祀RNA的降解；(2)抑制DNA的復制和轉錄及轉錄后的加工和翻譯等。可以說反義寡核苷酸(ODNs)療法比傳統的藥物治療手段有更高的特異性。從二本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種抗豬瘟病毒的肽核酸，其特征在于，所說的肽核酸為針對抗豬瘟病毒的C蛋白和/或Npro蛋白的反義核酸序列，所述的針對C蛋白的反義核酸序列選自SEQ?ID.1、SEQ?ID.2和SEQ?ID.3核苷酸序列中的一種或一種以上；所述的針對Npro蛋白的反義核酸序列選自SEQ?ID.4、SEQ?ID.5和SEQ?ID.6核苷酸序列中的一種或一種以上。

【技術特征摘要】
1.一種抗豬瘟病毒的肽核酸，其特征在于，所說的肽核酸為針對抗豬瘟病毒的C蛋白和/或Npn5蛋白的反義核酸序列，所述的針對C蛋白的反義核酸序列選自SEQ ID.1、SEQID.2和SEQ ID.3核苷酸序列中的一種或一種以上；所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：韓健寶，曲向陽，顧宏偉，王遠孝，馬國輔，
申請(專利權)人：韓健寶，
類型：發明
國別省市：