dsRNA及其組合在控制蚜蟲危害中的應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了dsRNA及其組合在控制蚜蟲危害中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)提供的dsRNA，為如下1）、2）或3）：1）由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA；2）由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA；3)由如下兩條雙鏈RNA組成：1）所示的雙鏈RNA和2）所示的雙鏈RNA。本發(fā)明專利技術(shù)的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明專利技術(shù)得到麥長(zhǎng)管蚜生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和22544cDNA的dsRNA，采用體外飼喂dsRNA方法，進(jìn)行了利用RNAi技術(shù)沉默麥長(zhǎng)管蚜體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和22544，導(dǎo)致麥長(zhǎng)管蚜生長(zhǎng)發(fā)育受阻并產(chǎn)生致死效應(yīng)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物
，尤其涉及dsRNA及其組合在控制蚜蟲危害中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
麥蚜(尤其是麥長(zhǎng)管蚜)是危害中國(guó)小麥生產(chǎn)的主要害蟲之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年小麥蚜蟲危害面積可高達(dá)0.17億公頃，占小麥總種植面積的62%，造成減產(chǎn)15% — 30%，嚴(yán)重時(shí)可高達(dá)50%。近年來(lái)，由于全球氣候變暖、耕作制度變化等因素，使蚜蟲的繁殖能力和適應(yīng)性顯著增強(qiáng)，其危害日趨嚴(yán)重。目前，蚜蟲防治以噴灑農(nóng)藥為主，但大量使用農(nóng)藥，不僅對(duì)人畜有害，而且造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。培育抗蚜蟲小麥和蔬菜品種是防止蚜蟲危害的最有效途徑，但由于現(xiàn)有種質(zhì)資源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性機(jī)制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通過(guò)基因工程培育小麥抗蚜新種質(zhì)具有重要意義。植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)已成為農(nóng)作物抗蟲基因工程的熱點(diǎn)之一，通過(guò)寄主植物表達(dá)相應(yīng)昆蟲特異基因的dsRNA，昆蟲取食植物后沉默其相應(yīng)的基因從而達(dá)到控制害蟲危害的目的。RNAi現(xiàn)象其作用過(guò)程是雙鏈RNA( dsRNA)進(jìn)入生物體內(nèi)，被Dicer酶切割成2l_23nt的siRNA，siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合，與互補(bǔ)序列的靶mRNA結(jié)合，被Dicer識(shí)別，造成靶基因表達(dá)量的下降。近年來(lái)，利用dsRNA體外飼喂或注射來(lái)篩選RNA靶標(biāo)基因，導(dǎo)致靶標(biāo)基因表達(dá)和沉默，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因的鑒定和功能分析。孟山都公司通過(guò)植物介導(dǎo)的昆蟲腸道特異基因RNAi技術(shù)成功獲得了抗玉米根螟的轉(zhuǎn)基因玉米，有效緩解了長(zhǎng)期應(yīng)用Bt轉(zhuǎn)基因玉米誘發(fā)昆蟲產(chǎn)生抗性等問(wèn)題，目前已完成生產(chǎn)性試驗(yàn)。棉鈴蟲腸道中特異P450基因可提高棉鈴蟲幼蟲對(duì)棉花次生代謝物質(zhì)和棉酚的耐受性，試驗(yàn)表明，利用表達(dá)棉鈴蟲P450基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草和棉花葉片飼喂棉鈴蟲幼蟲，可導(dǎo)致幼蟲體內(nèi)P450基因的表達(dá)量下降，同時(shí)幼蟲發(fā)育受阻，表現(xiàn)出抗棉鈴蟲性能；Zha等從褐飛虱中腸中克隆了 3個(gè)高度表達(dá)的基因:N1HT1、Nlcar和Nltry，構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化水稻，褐飛虱取食轉(zhuǎn)基因水稻后，體內(nèi)3種基因的mRNA表達(dá)水 平下降了 40%到70%，并且在水稻的篩管部發(fā)現(xiàn)了 dsRNA和siRNA的存在。Pitino等將桃蚜的MpC002 (主要在唾液腺中表達(dá))和Rack-1(主要在腸道中表達(dá))2個(gè)基因分別導(dǎo)入煙草和擬南芥中，用轉(zhuǎn)基因植物飼喂桃蚜，導(dǎo)致桃蚜體內(nèi)的MPC002或Rack-1的表達(dá)量降低了高達(dá)60%，蚜蟲的產(chǎn)仔數(shù)目減少。小麥抗蚜蟲種質(zhì)資源缺乏，抗性機(jī)制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效，每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。迫切需要挖掘和鑒定新型抗蚜基因并通過(guò)基因工程育種提高小麥抗蚜特性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的一個(gè)目的是提供了 dsRNA。本專利技術(shù)提供的dsRNA，為如下1)、2)或3):I)由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ；2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ；3)由如下兩條雙鏈RNA組成:I)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA。上述3)所示的dsRNA中，I)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA的質(zhì)量比為1:1。上述1)、2)或3)所示的所述dsRNA的編碼基因也是本專利技術(shù)保護(hù)的范圍，具體如下:I)所示的dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列I所示的核苷酸；2)所示的dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列2所示的核苷酸；3)所示的dsRNA的編碼基因具體為由序列表中序列I所示的核苷酸所示的DNA分子和序列表中序列2所示的核苷酸所示的DNA分子組成的組合物。上述dsRNA或上述的編碼基因的下述任一種應(yīng)用也是本專利技術(shù)保護(hù)的范圍:I)在防治蚜蟲中的應(yīng)用或在制備防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用；2)在促進(jìn)蚜蟲死亡中的應(yīng)用或在制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用；3)在抑制ill牙蟲生長(zhǎng)中的應(yīng)用或在制備抑制ill牙蟲生長(zhǎng)廣品中的應(yīng)用； 4)在抑制蚜蟲體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和/或22544的表達(dá)中的應(yīng)用或在制備抑制蚜蟲體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和/或22544的表達(dá)產(chǎn)品中的應(yīng)用。上述應(yīng)用為將上述dsRNA導(dǎo)入蚜蟲，實(shí)現(xiàn)防治蚜蟲、促進(jìn)蚜蟲死亡、抑制蚜蟲生長(zhǎng)、抑制蚜蟲體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和/或22544的表達(dá)；所述導(dǎo)入具體為飼喂； 所述蚜蟲具體為麥長(zhǎng)管蚜。上述基因8273的核苷酸序列為序列表中的序列1，基因22544的核苷酸序列為序列表中的序列2。含有上述dsRNA的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒也是本專利技術(shù)保護(hù)的范圍。上述重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒的下述任一種應(yīng)用也是本專利技術(shù)保護(hù)的范圍:I)在防治蚜蟲中的應(yīng)用或在制備防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用；2)在促進(jìn)蚜蟲死亡中的應(yīng)用或在制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用；3)在抑制蚜蟲生長(zhǎng)中的應(yīng)用或在制備抑制蚜蟲生長(zhǎng)產(chǎn)品中的應(yīng)用；4)在抑制蚜蟲體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和/或22544的表達(dá)中的應(yīng)用或在制備抑制蚜蟲體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和/或22544的表達(dá)產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述蚜蟲具體為麥長(zhǎng)管蚜。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是提供產(chǎn)品，其活性成分為如下A-C中至少一種:A、上述 dsRNA;B、上述的編碼基因；C、上述重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒；所述產(chǎn)品為如下I) -4)中任意一種:1)防治蚜蟲產(chǎn)品；2)促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品；3)抑制蚜蟲生長(zhǎng)產(chǎn)品；4)抑制蚜蟲體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和/或22544的表達(dá)產(chǎn)品；所述蚜蟲具體為麥長(zhǎng)管蚜。抑制蚜蟲體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和/或22544表達(dá)的物質(zhì)的下述任一種應(yīng)用也是本專利技術(shù)保護(hù)的范圍:I)在防治蚜蟲中的應(yīng)用或在制備防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用；2)在促進(jìn)蚜蟲死亡中的應(yīng)用或在制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用；3)在抑制蚜蟲生長(zhǎng)中的應(yīng)用或在制備抑制蚜蟲生長(zhǎng)產(chǎn)品中的應(yīng)用所述蚜蟲具體為麥長(zhǎng)管蟲牙。本專利技術(shù)中抑制蚜蟲體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和/或22544表達(dá)的物質(zhì)為上A-C中任意一種。本專利技術(shù)的實(shí)驗(yàn)證明，本專利技術(shù)得到麥長(zhǎng)管蚜生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和22544cDNA的序列的dsRNA，采用體外飼喂dsRNA方法，無(wú)論是單獨(dú)飼喂一種dsRNA還是飼喂dsRNA的混合物，均導(dǎo)致麥長(zhǎng)管蚜產(chǎn)生致死效應(yīng)，并且隨著dsRNA濃度增大和飼喂時(shí)間延長(zhǎng)，麥長(zhǎng)管蚜的死亡率均逐漸增大，研究表明利用RNAi技術(shù)沉默麥長(zhǎng)管蚜體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和22544表達(dá)。表明蚜蟲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和22544的保守序列可應(yīng)用于通過(guò)植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)提高小麥抗蚜性的研究。附圖說(shuō)明圖1為基因8273、22544和GFP的PCR擴(kuò)增圖2為飼喂8天后麥長(zhǎng)管蚜的生長(zhǎng)發(fā)育情況具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中麥長(zhǎng)管蚜(錢幼亭，周廣和，張淑香，張向才.麥長(zhǎng)管蚜有性世代的研究.植物保護(hù)，1982，1:14-15。公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，飼養(yǎng)蚜蟲的小麥品種為科農(nóng)199，將蚜蟲接種到小麥幼苗上，放入人工氣候箱中(溫度(20±2) °C，濕度60% — 80%，光周期L: D=16: 8)進(jìn)行繁殖。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Bi本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
dsRNA，為如下1）、2）或3）：1）由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA；2）由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA；3)由如下兩條雙鏈RNA組成：1）所示的雙鏈RNA和2）所示的雙鏈RNA。

【技術(shù)特征摘要】
1.sRNA，為如下 1),2)或 3): O由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ； 2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA； 3)由如下兩條雙鏈RNA組成:I)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA。2.據(jù)權(quán)利要求1所述的dsRNA，其特征在于:所述3)所示的dsRNA中，I)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA的質(zhì)量比為1:1。3.利要求1中1)、2)或3)所示的所述dsRNA的編碼基因； 1)所示的dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列I所示的核苷酸； 2)所示的dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列2所示的核苷酸； 3)所示的dsRNA的編碼基因具體為由序列表中序列I所示的核苷酸所示的DNA分子和序列表中序列2所示的核苷酸所示的DNA分子組成的組合物。4.利要求1或2所述dsRNA或權(quán)利要求3所述的編碼基因的下述任一種應(yīng)用: 1)在防治蚜蟲中的應(yīng)用或在制備防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用； 2)在促進(jìn)蚜蟲死亡中的應(yīng)用或在制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用； 3)在抑制Φ牙蟲生長(zhǎng)中的應(yīng)用或 在制備抑制Φ牙蟲生長(zhǎng)廣品中的應(yīng)用； 4)在抑制蚜蟲體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和/或22544的表達(dá)中的應(yīng)用或在制備抑制蚜蟲體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因8273和/或22544的表達(dá)產(chǎn)品中的應(yīng)用。5.據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用為將權(quán)利要求1或2所述dsRNA導(dǎo)入蚜蟲，實(shí)現(xiàn)防治蚜...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：夏蘭琴，張珉，李雪峰，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：