抗乙型肝炎病毒人工miRNA及其組合制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明專利技術(shù)涉及針對(duì)乙型肝炎病毒(hepatitis?B?virus，HBV)的人工miRNA(articifical?miRNA，amiRNA)及其組合在治療HBV感染疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的方法針對(duì)HBV不同基因型的保守區(qū)分別設(shè)計(jì)和構(gòu)建了amiRNA及其真核表達(dá)載體，通過(guò)體內(nèi)外篩選發(fā)現(xiàn)了17條可顯著抑制HBV復(fù)制的amiRNA及其不同的amiRNA組合。因此，本發(fā)明專利技術(shù)涉及的amiRNA及其組合有望成為治療乙型肝炎病毒相關(guān)疾病的新型治療藥物和手段。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥
，具體地說(shuō)，本專利技術(shù)涉及抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的人工miRNA(articifical miRNA,amiRNA)表達(dá)序列及其組合在治療HBV感染疾病中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
HBV感染是當(dāng)前威脅人類健康嚴(yán)重的傳染病之一，與HBV感染相關(guān)的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌每年約導(dǎo)致100多萬(wàn)人死亡。我國(guó)是HBV感染大國(guó)屬于高流行區(qū)，HBV感染不僅危害我國(guó)人民的健康，給患者及其家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，而且給國(guó)家造成了巨大的勞動(dòng)力和經(jīng)濟(jì)損失，乃至導(dǎo)致嚴(yán)重的就業(yè)等社會(huì)問(wèn)題。目前臨床有效的治療HBV藥物主要包括干擾素和核苷類藥物。干擾素治愈率有限，副作用較多，核苷類藥物存在容易引起HBV突變耐藥和停藥后易復(fù)發(fā)，因此新型抗HBV藥物的研發(fā)具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。miRNA是一種大小約22nt的非編碼小分子單鏈RNA，由一段具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度約為70-80nt的單鏈RNA前體剪切后生成。miRNA序列靠近5'端的I 7個(gè)核苷酸種子區(qū)是靶基因結(jié)合的區(qū)域，當(dāng)miRNA與mRNA不完全互補(bǔ)時(shí)，miRNA結(jié)合到mRNA的3 ^端非翻譯區(qū)抑制其翻譯，當(dāng)miRNA與mRNA完全互補(bǔ)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致靶mRNA降解。在保持發(fā)夾狀miRNA莖環(huán)前體的結(jié)構(gòu)和能量特征不變的條件下改變堿基，可產(chǎn)生與自然miRNA具有相同長(zhǎng)度、但與自然miRNA序列完全無(wú)關(guān)的小RNA，這種小RNA分子就是amiRMA。amiRNA利用內(nèi)源miRNA前體人工合成具有靶向任何基因的miRNA并以此下調(diào)該特定基因的表達(dá)。這種通過(guò)amiRNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)的特異基因高效穩(wěn)定沉默是RNAi發(fā)展過(guò)程中的又一重大突破，已經(jīng)成為分子生物學(xué)和藥物研發(fā)的有力工具。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供治療HBV感染的amiRNA表達(dá)序列及其組合，其使用方式及攜帶其的表達(dá)載體。具體地說(shuō)，本專利技術(shù)涉及具有抑制HBV病毒復(fù)制能力的amiRNA表達(dá)序列及其組合在制備治療HBV感染引起的相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。本專利技術(shù)提供的靶向HBV的amiRNA表達(dá)序列可抑制HBV的復(fù)制和病毒基因的表達(dá)。本專利技術(shù)提供的amiRNA表達(dá)序列是通過(guò)以下方法獲得的:選擇設(shè)計(jì)可靶向HBV病毒基因保守區(qū)的RNA干擾靶點(diǎn)序列，將該靶點(diǎn)序列及其的反向互補(bǔ)序列替換鼠源pre-miRNA155的miRNA成熟區(qū)，并克隆入amiRNA表達(dá)載體ρΟΚ-basic (生物技術(shù)通訊，2012，23 (6):91-95.)獲得相應(yīng)的amiRNA表達(dá)質(zhì)粒,將該質(zhì)粒分別與HBV感染性克隆質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平獲得有效的amiRNA表達(dá)序列。抑制HBV表達(dá)的amiRNA表達(dá)序列,該序列選自:(1)SEQ ID NO:1_17中任何一個(gè)所示的序列，或者(2)與(1)中序列具有至少70% (優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列，或者(3)上述序列的片段或者互補(bǔ)序列本專利技術(shù)還提供包含抑制HBV表達(dá)的amiRNA表達(dá)序列的組合，已達(dá)到防止病毒變異引起的逃逸并提高病毒抑制效果的目的。本專利技術(shù)還涉及了含有amiRNA表達(dá)序列及其組合的重組表達(dá)載體或病毒載體。本專利技術(shù)還涉及在基因組中或者基因組外攜帶本專利技術(shù)涉及的amiRNA表達(dá)序列及其組合的細(xì)胞，包含原核細(xì)胞和真核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物如人的細(xì)胞，優(yōu)選肝細(xì)胞和干細(xì)胞)。本專利技術(shù)還涉及本專利技術(shù)amiRNA表達(dá)序列及其組合、載體和細(xì)胞用于治療HBV感染或者HBV患者的用途。本專利技術(shù)的實(shí)施對(duì)嚴(yán)重危害人類健康的乙型肝炎及其相關(guān)疾病的治療具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。附圖說(shuō)明 為了更好的理解本專利技術(shù)的實(shí)質(zhì)，下面將結(jié)合附圖來(lái)對(duì)本專利技術(shù)進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。圖1為pOK-basic載體圖譜，用于amiRNA的構(gòu)建和表達(dá)。圖2顯示了靶向17個(gè)amiRNA表達(dá)序列質(zhì)粒在與HBV感染性克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞后顯示出的抑制HBV表達(dá)的能力，可抑制H印G2細(xì)胞中HBsAg和HBeAg的表達(dá)。圖3顯示了含有串聯(lián)amiRNA表達(dá)序列(組合)的質(zhì)粒在與HBV感染性克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后顯示出的抑制HBV表達(dá)的能力，可抑制HepG2細(xì)胞中HBsAg和HBeAg的表達(dá)。圖4顯示了含有串聯(lián)amiRNA表達(dá)序列(組合)的質(zhì)粒與HBV感染性克隆質(zhì)粒水動(dòng)力注射小鼠尾靜脈后，分別在2、5、9和14天尾靜脈取血，合適比例稀釋后檢測(cè)的HBsAg含量。串聯(lián)amiRNA表達(dá)序列(組合)在體內(nèi)顯示出較強(qiáng)抑制HBV復(fù)制的能力，可抑制HBV感染性克隆質(zhì)粒的表達(dá)，降低血清中HBsAg的水平。圖5顯示了含有串聯(lián)amiRNA表達(dá)序列(組合)的質(zhì)粒與HBV感染性克隆質(zhì)粒水動(dòng)力注射小鼠尾靜脈后，分別在2、5、9和14天尾靜脈取血，合適比例稀釋后檢測(cè)的HBeAg含量。串聯(lián)amiRNA表達(dá)序列(組合)在體內(nèi)顯示出較強(qiáng)抑制HBV復(fù)制的能力，可抑制HBV感染性克隆質(zhì)粒的表達(dá)，降低血清中HBeAg的水平。具體實(shí)施例方式本專利技術(shù)提供了一種通過(guò)amiRNA表達(dá)序列及其組合進(jìn)行抗HBV治療的新方法，以下通過(guò)實(shí)例對(duì)本專利技術(shù)做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)例僅僅用于解釋本專利技術(shù)，除非特別說(shuō)明，本專利技術(shù)的術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域通常使用的含義。本專利技術(shù)提供了可靶向HBV的amiRNA表達(dá)序列，包含如下序列或與其至少有70%(優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列中的任何一個(gè)或幾個(gè)序列:SEQ ID NO:1-17。—致性(identity)可以按照本領(lǐng)域公知的方法計(jì)算。適合于確定序列一致性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的一個(gè)優(yōu)選例子是BLAST和BLAST2.0算法。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過(guò)國(guó)立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。依據(jù)本專利技術(shù)amiRNA表達(dá)序列指的是通過(guò)設(shè)計(jì)表達(dá)或設(shè)計(jì)合成等方式得到的靶向HBV的序列。當(dāng)其通過(guò)質(zhì)粒形式進(jìn)行表達(dá)時(shí)使用的啟動(dòng)子可以是任何適于在細(xì)胞中表達(dá)目的基因的啟動(dòng)子。可以是組成型的，也可以是誘導(dǎo)性的。實(shí)施例一靶向HBV的amiRNA表達(dá)載體質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建靶向HBV的amiRNA表達(dá)序列的設(shè)計(jì):以HBV參考序列為靶序列，選擇設(shè)計(jì)可靶向HBV病毒基因保守區(qū)的RNA干擾靶點(diǎn)序列，將該靶點(diǎn)序列及其的反向互補(bǔ)序列替換鼠源pre-miRNA155的miRNA成熟區(qū)，并克隆入amiRNA表達(dá)載體pOK-basic (圖例I)獲得相應(yīng)的amiRNA表達(dá)質(zhì)粒。實(shí)施例二共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)篩選可抑制HBV的amiRNA表達(dá)序列材料與方法1.細(xì)胞培養(yǎng)所用 細(xì)胞為為肝癌細(xì)胞H印G2，用含5%胎牛血清(FBS，Hyclone)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液37°C、5% C02條件下培養(yǎng)。2.ρΟΚ-basic-amiRNA質(zhì)粒由本專利技術(shù)提供；HBV復(fù)制型質(zhì)粒pHBVl.31含1.31拷貝HBV DNA并有完整復(fù)制單元，其能在轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞內(nèi)完成病毒的復(fù)制，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中可檢測(cè)到HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞上清可檢測(cè)到病毒復(fù)制中間體。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞在含5% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對(duì)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
抑制HBV的amiRNA表達(dá)序列，該序列選自：1.1SEQ?ID?NO：1?17中任何一個(gè)所示的序列，或者1.2與1.1中序列具有至少70％(優(yōu)選至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列，或者1.3上述序列的片段或者互補(bǔ)序列。

【技術(shù)特征摘要】
1.制HBV的amiRNA表達(dá)序列，該序列選自: 1.1SEQ ID NO:1-17中任何一個(gè)所示的序列，或者 1.2與1.1中序列具有至少70% (優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列，或者 1.3上述序列的片段或者互補(bǔ)序列。2.制HBV的amiRNA表達(dá)序列組合，其特征在于所述組合含有權(quán)利要求1所述的amiRNA表達(dá)序列。3.一種基因治療載體，該載體可以是質(zhì)粒載體或病毒載...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王升啟，王學(xué)軍，李英，黃海，張秀娟，謝佩雯，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：