本發明專利技術公開了一種可以調控人參皂苷積累的PDR轉運蛋白基因啟動子及其應用，該啟動子ProPDR1的DNA序列如SEQIDNo.1所示，或是與SEQIDNo.1具有99%以上同源性的DNA序列。本發明專利技術采用基因組步移技術(Genomewalker)克隆得到PgPDR1轉運蛋白基因啟動子序列，該序列包含TCA元件和TCCACCT-Motif。本發明專利技術構建啟動子表達載體pBI121-ProPDR1::GUS，在啟動子ProPDR1的驅動下，報告基因GUS在轉基因煙草中可較強地受人參皂苷、水楊酸、茉莉酸甲酯和脫落酸的調控，表明該啟動子啟動的人參PgPDR1基因表達與人參皂苷的積累密切相關。因此，本發明專利技術提供的啟動子，在藥用植物次生代謝產物的合成與積累調控的基因工程中具有十分重要的應用價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于植物基因工程
，具體涉及一個可以調控人參皂苷積累的TOR轉運蛋白基因的啟動子。
技術介紹
人參0°.ginseng C.A.Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物,是名貴中藥材。人參中含有多種藥用成分，其中人參皂苷是人參最主要的活性成分。目前已從人參根中分離出50余種人參皂苷，現代醫學研究證明各皂苷單體具有重要的藥用價值，且已廣泛應用于臨床。但是其中一些具有抗腫瘤、抗衰老、抑制細胞凋亡和增強免疫力等活性強的皂苷含量極低。利用人參皂苷合成代謝相關的基因調控技術促進人參皂苷的合成與積累具有重要的理論價值和應用前景。基因的有效轉錄和表達是發揮其基因功能的重要條件，基因成功轉錄和表達需要依靠啟動子對其的調控，啟動子與RNA聚合酶、轉錄調控因子等相互作用發揮其調控的功能。真核生物中的TATA和CAAT框，它們決定了轉錄的起始位點和效率，負責和RNA聚合酶結合，啟動基本轉錄過程。啟動子組件有許多不同的類型，包括病原誘導型作用元件、組織特異型作用元件和化學誘導作用元件等。其中化學物質誘導型作用元件在促進次生代謝產物合成方面起重要作用。在次生代謝產物合成與積累相關基因的表達過程中，順式作用元件通過與轉錄因子的相互作用發揮著重要調控作用:環境刺激經過一系列信號轉導、傳遞后，激活防衛相關轉錄因子與特異順式作用元件的相互作用，從而實現相關防衛功能基因的表達。鑒于順式作用元件的上述重要調控作用，使用誘導型啟動子介導的抗性基因無疑具有多方面的優勢，因此鑒定次生代謝產物合成與積累相關的誘導型啟動子已成為目前植物分子生物學研究的熱點之一。在人參`次`生代謝調控中，可以通過導入關鍵酶等基因調控合成途徑中的多步限速反應，或者通過順式作用元件在轉錄水平調控人參皂苷合成、轉運和積累相關基因的表達，從而提聞人參阜昔的含量。植物ABC (ATP-binding cassette transporter)轉運蛋白是目前已知最大，功能最廣泛的蛋白家族，ABC轉運蛋白屬跨膜運輸蛋白，利用水解ATP釋放的能量轉運有機酸、生物堿、細胞代謝產物和藥物等。參與細菌耐藥性、次生代謝產物積累、脅迫反應和腫瘤抗藥性等。ABC轉運蛋白家族包括多向耐藥性蛋白(pleiotropic drug resistance,PDR),多藥耐藥性蛋白(multidrug resistance, MDR)等。PDR是其中最大的亞族,是植物和真菌中特有的一種ABC轉運蛋白。但目前對植物PDR基因相關研究甚少，離體細胞培養中，香紫蘇醇可誘導層基因上調表達，在細胞內NpTORl蛋白累積增強了細胞向胞外轉運香紫蘇醇以及其類似物的能力。擬南芥(A細胞內香紫蘇醇的累積亦能誘導基因上調表達，同時在細胞外檢測到AtH)R12蛋白向胞外轉運的香紫蘇醇，推測萜類物質可能是基因表達的上游調控物質。矮牽牛中PhTORl蛋白可以轉運一種新發現的植物激素-獨角金內酯，進而促進矮牽牛分枝。因而，PDR轉運蛋白基因在調控次生代謝產物的積累方面具有重要的潛力。然而，在人參中尚無PDR蛋白基因及其調控元件的報道。
技術實現思路
本專利技術旨在從人參中分離出受人參皂苷等化學物質誘導調控的誘導型啟動子，從而提供一種能夠調控人參皂苷轉運與積累相關的基因資源，為今后開發基因工程產品奠定基礎。為實現上述專利技術目的，本專利技術提供了一種調控人參皂苷轉運與積累的基因的啟動子ProPDRl，其序列如SEQ ID N0.1所示。本專利技術的啟動子ProPDRl的序列也可以是與SEQ ID N0.1具有99%以上同源性的DNA序列。本專利技術提供的啟動子ProPDRl的制備方法為:(I)提取人參根基因組總DNA，以人參根總DNA為模板，構建四個啟動子文庫'Dral文庫、V文庫、Pvu II文庫和Stu I文庫；(2)分別以構建的文庫、&0R V文庫II文庫和I文庫為模板，根據人參PgPDRl基因的5'端序列設計引物，進行PCR擴增；(3)膠回收PCR產物，該產物即得本專利技術所述的啟動子ProPDRl。在上述方法中，所述步驟(2)中根據人參基因的5'端序列設計的引物為一個引物對:外側引物和巢式引物，外側引物如SEQ ID N0.2所示，巢式引物如SEQ ID N0.3所示。本專利技術還提供了含有ProPDRl啟動子的重組載體，具體包括:植物表達載體ΡΒΙ121，即就是將ProPDRl啟動子連接到空載體ρΒΙ121中，獲得ProPDRl啟動子驅動的⑶S報告基因的重組載體pBI121-ProroRl::⑶S。ProPDRl啟動子亦可克隆到其他空載體中，或制備成轉基因細胞及重組菌。本專利技術提供的重組載體pBI121-ProroRl::⑶S的構建方法為:(1)根據ProPDRl啟動子序列設計片段相對應的包含lll/Bam HI酶切位點的特異性引物，分別用BamHI和Nco I雙酶切pBI 121和啟動子ProPDRl，回收pBI 121載體和ProPDRl啟動子片段；(2 )將兩片段連接并轉化DH5a ; (3)通過卡那霉素篩選、PCR和Bam HI/Nco I雙酶切鑒定，SP獲得所述重組載體pBI121-ProPDRl::⑶S。上述重組載體pBI121-ProPDRl::⑶S的構建中，步驟(I)根據ProPDRl啟動子序列設計片段相對應的包含歷id lll/Bam HI酶切位點的特異性引物如SEQ ID N0.4和SEQID N0.5所示。步驟(3)中PCR鑒定所設計的引物如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。本專利技術的研究表明具有促進調控人參皂苷轉運和積累方面的功能，因此提供了ProroRi啟動子以及含啟動子的重組載體在調控人參皂苷轉運與積累中以及在人參育種中的應用。本專利技術利用植物基因工程技術，根據已克隆的人參PgPDRl基因的5'端序列，采用基因組步查(Genowalker )技術分離ProTORl啟動子序列，構建ProTORl::⑶S報告基因的重組表達載體，并通過根癌農桿菌介導法將基因轉入煙草，經過異源表達鑒定證明ProTORl對⑶S報告基因轉錄與表達的驅動功能。ProTORl啟動子驅動的⑶S基因表達具有組織特異性且受水楊酸、赤霉素和人參皂苷等化學物質的誘導，表明所述ProPDRl啟動子具有促進調控人參皂苷轉運和積累方面的功能?？梢酝ㄟ^該啟動子或其衍生物 調控或改良人參及其它植物，獲得人參皂苷含量高的優良植物品種，這對于后續克隆人參皂苷轉運信號途徑中的關鍵的調控轉錄因子基因，以及為通過轉基因方法調控人參皂苷等萜類化合物的轉運與積累等研究奠定了基礎。附圖說明圖1是本專利技術擴增的人參ProPDRl啟動子片段電泳結果；圖中，I表示PCR擴增產物，M表不Marker ； 圖2是本專利技術擴增的人參ProTORl啟動子順式作用元件分析 圖3是轉基因煙草中擴增的人參ProPDRl啟動子片段電泳結果；圖中，Γ6表示PCR擴增產物，M表示Marker ； 圖4是本專利技術的ProPDRl啟動子啟動⑶S報告基因在轉基因煙草不同組織中的表達水平 圖5是本專利技術的ProI3DRl啟動子啟動⑶S報告基因在20 μ M GA、50 μ M SA、20 μ M ΑΒΑ和20mg/L GS誘導下表達水平圖，其中GA為赤霉素、SA為水楊酸、AB本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種人參皂苷積累的PDR轉運蛋白基因啟動子，其特征在于，所述的啟動子的DNA序列如SEQ?NO.1所示，或是與SEQ?ID?NO.1具有99%以上同源性的DNA序列。
【技術特征摘要】
1.一種人參皂苷積累的roR轉運蛋白基因啟動子，其特征在于，所述的啟動子的DNA序列如SEQ N0.1所示，或是與SEQ ID N0.1具有99%以上同源性的DNA序列。2.根據權利要求1所述的啟動子的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟:(1)提取人參根基因組總DNA，以人參根總DNA為模板，構建四個啟動子文庫'Dral文庫、V文庫、Pvu II文庫和I文庫；(2)分別以構建的文庫、V文庫、II文庫和Stu I文庫為模板，根據人參作/Wl基因的5'端序列設計引物，進行PCR擴增；(3)膠回收PCR產物，該產物即得本發明所述的啟動子ProPDRl。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中根據人參基因的5'端序列設計的引物為一個引物對:外側引物和巢式引物，外側引物如SEQ ID N0.2所示，巢式引物如SEQ ID N0.3所示。4.有權利要求1所述啟動子的重組載體，其特征在于:所述重組載體為pBI121-ProroRl::⑶S，其中空載體為ρΒΙ121載體，在ProPDRl啟動子的下游連接⑶S報告基因。5.按權利要求4所述的重組載體的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：羅志勇，張儒，黃景嘉，陳湘暉，羅俊，李繼佳，
申請(專利權)人：中南大學，
類型：發明
國別省市：
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