一種沉默人乳腺癌特異基因的shRNA制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種沉默人乳腺癌特異基因的shRNA，其正義鏈序列如序列表SEQ?NO.1所示，其反義鏈序列如序列表SEQ?NO.2所示。本發(fā)明專利技術(shù)所述的shRNA是通過對(duì)人乳腺癌特異基因(breast?cancer?special?gene1，BCSG1)的mRNA序列設(shè)計(jì)、合成并構(gòu)建了shRNA表達(dá)載體，通過功能性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到了有效抑制腫瘤細(xì)胞BCSG1表達(dá)的shRNA。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了所述shRNA的應(yīng)用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種shRNA的構(gòu)建及應(yīng)用。具體而言，本專利技術(shù)針對(duì)人乳腺癌特異基因(breast cancer special gene I, BCSG1)的核苷酸序列設(shè)計(jì)合成shRNA，所述shRNA轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞后能抑制所述腫瘤細(xì)胞的BCSGl基因的表達(dá)。
技術(shù)介紹
乳腺癌特異基因(breast cancer special genel,BCSGl)則是一種特異的在乳腺癌中有選擇性表達(dá)的新基因，是1997年用cDNA直接測(cè)序法發(fā)現(xiàn)的乳腺癌相關(guān)基因，定位于染色體10q23，轉(zhuǎn)錄mRNA全長(zhǎng)約10Kb，含5個(gè)外顯子，有一 38Ibp的開放讀碼框架，編碼一127個(gè)氨基酸的多肽鏈。BCSGl基因與1998年Lavedan等確認(rèn)的SNCs家族新成員SNCG幾乎為同一基因，因此又可稱為SNCG, persyrioBCSGl是一種特異的在乳腺癌中有選擇性表達(dá)的新基因，BCSGl對(duì)乳腺癌的進(jìn)展起明顯促進(jìn)作用，BCSGl呈陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌有更多浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移傾向；前期研究發(fā)現(xiàn)，BCSGl可作為“三陰性”乳腺癌亞型治療和預(yù)后的評(píng)估因子。乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要因素，最近的研究表明，在乳腺癌的局部浸潤(rùn)過程中伴隨著上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymaltransition,EMT)的發(fā)生。免疫細(xì)胞化學(xué)分析提示BCSGl與乳腺癌細(xì)胞胞質(zhì)的膜結(jié)構(gòu)有關(guān)，通過影響細(xì)胞骨架組成的變化參與調(diào)節(jié)乳腺癌上皮細(xì)胞網(wǎng)，促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)程。這與EMT通過使腫瘤基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的破壞以及細(xì)胞骨架的重建、細(xì)胞間黏附的喪失而導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)和遷移的作用機(jī)理相似。由于BCSGl基因只在乳腺癌中特異性高表達(dá)，在正常組織低表達(dá)或不表達(dá)，預(yù)示著針對(duì)BCSGl的高選擇性分子靶向藥物在乳腺癌個(gè)體化治療方面的廣泛前景。RNA干擾是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性基因沉默現(xiàn)象[Fire A, Xu SQ, MontgomeryMK, et al.Potent and specific genetic interference bydouble-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Naturel998 ;391:806-811],因其具有沉默效率高、特異性強(qiáng)以及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)于傳統(tǒng)基因敲除手段的優(yōu)點(diǎn)而得到迅速發(fā)展。shRNA 即小發(fā)卡 RNA 或者短發(fā)卡 RNA(a small hairpin RNA or short hairpinRNA, shRNA)，是一段外源性的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列，能夠在細(xì)胞內(nèi)加工成siRNA，siRNA進(jìn)而與蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC)。該復(fù)合物能夠結(jié)合到同源的mRNA上并誘導(dǎo)其降解。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最普遍的生物學(xué)特征，也是影響患者生存和預(yù)后的關(guān)鍵因素，為了降低腫瘤細(xì)胞BCSGl基因的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，本專利技術(shù)構(gòu)建了針對(duì)BCSGl分子的shRNA，所述shRNA轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞后，有效抑制了乳腺癌細(xì)胞的BCSGl基因的表達(dá)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中人乳腺癌特異基因(breast cancer special gene1，BCSG1)的mRNA序列以及shRNA的引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了 3條針對(duì)BCSGl基因的干擾序列，另外還設(shè)計(jì)了無(wú)干擾效果的陰性對(duì)照和干擾GAPDH的陽(yáng)性對(duì)照干擾序列，并將設(shè)計(jì)完成shRNA的序列送生工生物(上海)有限公司進(jìn)行合成。上述3條針對(duì)BCSGl基因的干擾序列其shRNA引物序列如下:干擾I的正義鏈序列如序列表SEQ ID N0.1所示，其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.2所示，干擾I的靶點(diǎn)序列如序列表SEQ ID N0.3所示；干擾2的正義鏈序列如序列表SEQ ID N0.4所示，其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.5所示，干擾2的靶點(diǎn)序列如序列表SEQ ID N0.6所示；干擾3的正義鏈序列如序列表SEQ ID N0.7所示，其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.8所示，干擾3的靶點(diǎn)序列如序列表SEQ ID N0.9所示。上述無(wú)干擾效果的陰性對(duì)照其siRNA序列如序列表SEQ ID N0.10所示，其正義鏈序列如序列表SEQ ID N0.11所示，其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.12所示；干擾GAPDH的陽(yáng)性對(duì)照其siRNA序列如序列表SEQ ID N0.13所示，其正義鏈序列如序列表SEQ IDN0.14所示,其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.15所示。本專利技術(shù)將上述設(shè)計(jì)的干擾序列、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的shRNA引物常規(guī)退火后合成雙鏈，得到退火片段；雙酶切pGCs1-1質(zhì)粒，將退火片段分別與酶切后的pGCs1-1質(zhì)粒連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取單菌落進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，得到了陽(yáng)性的克隆和質(zhì)粒。 本專利技術(shù)將陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照與3條干擾基因的載體及空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，本專利技術(shù)通過RT-PCR方法檢測(cè)了乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中BCSGlmRNA的表達(dá)量，結(jié)果顯示:干擾I的干擾效果最好，使腫瘤細(xì)胞中MDA-MB-231的mRNA表達(dá)量降低了 49.63% ;干擾2的干擾效果次之，使腫瘤細(xì)胞中MDA-MB-231的mRNA表達(dá)量降低了 43.68%，干擾3沒有干擾效果。本專利技術(shù)將陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照與3條干擾基因的載體及空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，通過Western blot技術(shù)檢測(cè)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中BCSGl蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示:干擾I的干擾效果最好，使腫瘤細(xì)胞中MDA-MB-231的蛋白質(zhì)表達(dá)量降低了 49 %;干擾2的干擾效果次之，使腫瘤細(xì)胞中MDA-MB-231的蛋白質(zhì)表達(dá)量降低了 44%，干擾3沒有干擾效果。以上結(jié)果顯示本專利技術(shù)所設(shè)計(jì)的干擾I和干擾2的shRNA能夠有效沉默細(xì)胞BCSGl基因的表達(dá)，所以本專利技術(shù)所述的干擾I和干擾2的shRNA可以用于沉默細(xì)胞BCSGl基因的表達(dá)和用于制備治療乳腺癌藥物。本專利技術(shù)還公開了一種降低細(xì)胞BCSGl基因的表達(dá)的方法，包括以下步驟:(I)轉(zhuǎn)染前一天，以合適的細(xì)胞密度接種到6cm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞要達(dá)到90%的融合度；(2)轉(zhuǎn)染前每個(gè)孔棄掉舊的培養(yǎng)基，加入5ml不含雙抗5% FBS的培養(yǎng)基；(3) 500 u I opt1-MEM和8 ii g含有干擾I序列的質(zhì)粒混合，室溫下靜置5min ；(4)將步驟(3)得到的混合物和20 u llip2000輕輕混勻，室溫下靜置20min ；(5)將質(zhì)粒和lip2000的混合液輕輕滴加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。(6)在37°C，5%的C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)；(7)6小時(shí)后，更換含有血清的全培養(yǎng)基，在37°C，5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 72h檢測(cè)BCSGl基因的表達(dá)水平。附圖說明圖1A圖為載體質(zhì)粒pGCs1-1雙酶切回收前電泳圖，B圖為回收之后電泳檢測(cè)圖，其中PG為未酶切pGCs1-1質(zhì)粒；圖2含干擾序列的pGCs1-1質(zhì)粒的檢測(cè)圖，其中I和2號(hào)質(zhì)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種shRNA，包括正義鏈和反義鏈，其特征在于，所述正義鏈的核苷酸序列如序列表SEQ?NO.1所示，所述反義鏈的核苷酸序列如序列表SEQ?NO.2所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種shRNA，包括正義鏈和反義鏈，其特征在于，所述正義鏈的核苷酸序列如序列表SEQ N0.1所示,所述反義鏈的核苷酸序列如序列表SEQ N0.2所示。2.權(quán)利要求1所述的shRNA在制備降低細(xì)胞BCSGlmRNA試劑中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求1所述的shRNA在制備抑制細(xì)胞BCSGl蛋白表達(dá)試劑中的應(yīng)用。4.一種降低細(xì)胞BCSGl表達(dá)的方法，具體步驟如下: (1)轉(zhuǎn)染前一天，以合適的細(xì)胞密度接種到6cm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞要達(dá)到90%的融合度。(2)轉(zhuǎn)染前每個(gè)孔棄調(diào)舊的培養(yǎng)基，加入5ml不含雙抗5%FB...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何勁松，陳偉財(cái)，葉偉亮，袁梓膳，王坤，李國(guó)勁，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：何勁松，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：