一種控制魚類生殖的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種控制魚類生殖的方法，其步驟：A，構(gòu)建重組基因CMV-eGFP-SV40-CMV-Gal4-SV40，建立轉(zhuǎn)GAL4基因斑馬魚家系；B，構(gòu)建重組基因CMV-RFP-SV40-UAS-antisensednd，建立轉(zhuǎn)uas-antisensednd基因斑馬魚家系；C，以兩個(gè)家系的轉(zhuǎn)基因魚純合子為親本雜交，雜交后代魚生殖敗育。本發(fā)明專利技術(shù)通過兩系可育而雜交子代誘導(dǎo)不育的策略，建立了一種具有普遍意義的控制魚類育性的新方法。該方法解決了生殖操作研究中魚的不育性與性狀的可遺傳性間的矛盾，能有效運(yùn)用于魚類新品種培育和種群控制。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種
，更具體涉及。采用魚類親本兩系可育而雜交子代誘導(dǎo)不育的策略，分別建立轉(zhuǎn)gal4基因魚家系和UAS驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)反義dnd基因魚家系，將兩個(gè)家系的轉(zhuǎn)基因魚雜交，可以在雜交子代中控制魚類的生殖發(fā)育，從而建立控制魚類生殖的操作技術(shù)，培育出性腺敗育的魚類新品系。
技術(shù)介紹
生長速度、肉質(zhì)等性狀是魚類品種改良的主要目標(biāo)，而魚類的生殖發(fā)育特性與這些重要性狀的關(guān)系非常密切。魚類能量生物學(xué)研究表明，如果控制了魚類的生殖發(fā)育，其攝取的食物將更有效地轉(zhuǎn)化成體細(xì)胞的發(fā)育，從而促進(jìn)生長。很多鮭鱒魚類性腺成熟排出性產(chǎn)物后，肉質(zhì)變得很差；而性腺發(fā)育不發(fā)育的魚體肌肉組織中人體必需氨基酸、呈味氨基酸的含量都比較高。因此，實(shí)施魚類生殖發(fā)育調(diào)控，對于培育具有優(yōu)良性狀的養(yǎng)殖魚類新品系具有重要指導(dǎo)意義。世界上第一批轉(zhuǎn)基因魚問世以來(ZhuZ, Li G, He L, et al.Novel gene transferinto the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratus L.1758).Z angewIchthyol，1985，1:31-34。)，以提供優(yōu)質(zhì)食品蛋白來源為目的，迄今已成功研制了 30多種轉(zhuǎn)基因魚。經(jīng)遺傳改良后的轉(zhuǎn)基因魚具有生長速度快，餌料轉(zhuǎn)化效率高，抗凍耐寒，抗疾病能力強(qiáng)等優(yōu)良性狀。但是，迄今尚無一例轉(zhuǎn)基因魚進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖，制約轉(zhuǎn)基因魚產(chǎn)業(yè)化的瓶頸因素在于對其可能的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂。從科學(xué)的角度而言，轉(zhuǎn)基因魚潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)實(shí)質(zhì)與其生殖特性密切相關(guān)。控制轉(zhuǎn)基因魚的生殖，可以從根本上解決轉(zhuǎn)基因魚的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)(Hu Wei, Wang Yaping & Zhu Zuoyan.Progress in the evaluation of transgenicfish for possi—ble ecologic al risk and its containment strategies.Science inChina Ser C-Life Sc1.2007,50:573-579.)。反義轉(zhuǎn)GnRH基因策略是目前控制轉(zhuǎn)基因魚生殖的首選技術(shù)(MacleanN, Laight R J.Transgenic fish:an evaluation of benefits and risks.Fish andFisheries，2000，1:146-172)。該技術(shù)首先通過反義轉(zhuǎn)基因阻遏與魚類性腺發(fā)育或性成熟相關(guān)基因GnRH的表達(dá)，進(jìn)而抑制其性腺發(fā)育，控制轉(zhuǎn)基因魚的生殖；在此基礎(chǔ)上，恢復(fù)不育的轉(zhuǎn)基因魚的生理育性，以最終獲得無生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)之虞的育性可控的轉(zhuǎn)基因魚。但是，采用該技術(shù)即使獲得了性腺完全不發(fā)育的轉(zhuǎn)基因魚，如何將轉(zhuǎn)基因魚“不育”的性狀遺傳給子代并建立家系，從邏輯學(xué)角度看是一個(gè)難以理解的悖論，在遺傳上則是一個(gè)難以實(shí)現(xiàn)的難題。盡管理論上可以通過人工補(bǔ)給外源激素恢復(fù)不育轉(zhuǎn)基因魚的生理育性，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，魚類中GnRH在魚腦中的表達(dá)最早可起始于受精發(fā)育的第一天，本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)在此階段補(bǔ)充外源GnRH對胚胎發(fā)育以及幼魚生長有抑制作用，這些限制造成育性恢復(fù)成功率很低。而且，即使恢復(fù)了極少數(shù)不育轉(zhuǎn)基因魚的生理育性，其產(chǎn)生的精子或卵子量非常少，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)需要。Gal4/UAS系統(tǒng)有可能成為一種較理想的誘導(dǎo)型的基因表達(dá)系統(tǒng)而應(yīng)用于魚類生殖發(fā)育調(diào)控。半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件Gal4 (Galactose regulated upstream promoterelement, Gal)是酵母中類似原核生物乳糖操縱子的一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子，Gal4蛋白既有DNA結(jié)合功能域，又有轉(zhuǎn)錄激活功能域。上游激活序列UAS (Upstream active sequence, UAS)是酵母中另一種類似高等真核生物增強(qiáng)子的序列。Gal4只有在識(shí)別UAS時(shí)才能激活與UAS相連接的下游基因的轉(zhuǎn)錄，對基因的誘導(dǎo)表達(dá)具有強(qiáng)烈的特異性及可控性(MarnieE.Halpern, Je rry Rhee, Mary G.Goll, Courtney Μ.Akitake, Michael Parsons,andSteven D.Leach.Gal 4/UAS Transgenic Tools and Their Application to Zebrafish.Zebrafish, 2008，5(2):97-110.)。原始生殖細(xì)胞是生殖細(xì)胞的前體細(xì)胞，dead end (dnd)基因在原始生殖細(xì)胞的存活和遷移具有重要作用(Gilbert Weidinger et al.dead end, a Novel Vertebrate GermPlasm Com ponent,Is Required for Zebrafish Primordial Germ Cell Migration andSurvival, Current bi ology, 2003，(13): 1429-1434.),抑制 dead end (dnd)基因的表達(dá),可以抑制原始生殖細(xì)胞的正常遷移，從而抑制生殖細(xì)胞的形成和成熟。斑馬魚(Danio rerio)是目前廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、水生生物技術(shù)等研究的模式魚(Westerfield M.1993.The Zebrafish Book:A Guide for the Laboratory Use ofZebrafish (Brachydanio rerio).University of Oregon Press, Eugene, OR.),以斑馬魚為模型探索控制魚類生殖的新方法，對于建立魚類的生殖開關(guān)技術(shù)，培育性腺敗育的經(jīng)濟(jì)性養(yǎng)殖魚類優(yōu)良品種以及控制自然環(huán)境中的外來魚類種群等方面具有重要的指導(dǎo)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供了一種控制魚類生殖發(fā)育的方法。該方法由兩個(gè)相對獨(dú)立但又相互聯(lián)系的轉(zhuǎn)基因魚家系組成:一個(gè)家系轉(zhuǎn)入由強(qiáng)啟動(dòng)子CMV驅(qū)動(dòng)的表達(dá)GAL4的載體，另一家系則轉(zhuǎn)入與UAS序列融合的反義dnd基因載體。兩個(gè)家系的轉(zhuǎn)基因魚單獨(dú)存在時(shí)均可正常產(chǎn)生成熟的生殖細(xì)胞，可以將性狀穩(wěn)定遺傳給后代。但是，一旦兩個(gè)轉(zhuǎn)基因家系雜交，在雜交后代中，GAL4將誘導(dǎo)UAS驅(qū)動(dòng)其下游的反義dnd表達(dá)，從而抑制內(nèi)源dnd基因的表達(dá)，鑒于dnd基因在原始生殖細(xì)胞的存活和遷移具有重要作用，因此，雜交后代個(gè)體中的原始生殖細(xì)胞無法完成正常遷移，最終導(dǎo)致生殖細(xì)胞無法形成，由此獲得生殖敗育的魚。該方法可以成為一種全新的魚類生殖操作育種新技術(shù)，應(yīng)用于培育具有優(yōu)良性狀的養(yǎng)殖魚類新品系、并可運(yùn)用于控制外來魚種的種群。為了達(dá)到上述的目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)措施:重組基因的構(gòu)建，其步驟是:(I)重組基因 CMV-eGFP-SV40-CMV-Gal4-SV40 的構(gòu)建:以 4xKGFP 載體(Martin Distela et al.0ptimized Gal4genetics for permanent gene expressionmapping in zebrafish.PNAS, 2009, 106:65-70.)為初始載體，經(jīng)過改造得到pSK-CMV-eGFP-SV40-CMV-MCS-SV40載體(其本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種控制魚類生殖的方法，其步驟是：（1）外源基因?qū)耄翰捎蔑@微注射法將重組基因CMV?eGFP?SV40?CMV?Gal4?SV40和CMV?RFP?SV40?UAS?antisense?dnd分別導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，得到P0代轉(zhuǎn)GAL4基因斑馬魚和轉(zhuǎn)UAS?antisense?dnd基因斑馬魚；所述的重組基因CMV?eGFP?SV40?CMV?Gal4?SV40，其序列為SEQ?ID?NO.1所示；所述的重組基因CMV?RFP?SV40?UAS?antisense?dnd，其序列為SEQ?ID?NO.2所示；（2）獲得轉(zhuǎn)基因魚純合子：表達(dá)綠色熒光蛋白的為P0代轉(zhuǎn)GAL4基因斑馬魚；表達(dá)紅色熒光蛋白的為P0代轉(zhuǎn)UAS?antisense?dnd基因斑馬魚；將兩種P0代轉(zhuǎn)基因斑馬魚分別與對照斑馬魚雜交，分別獲得F1代轉(zhuǎn)GAL4基因斑馬魚和轉(zhuǎn)UAS?antisense?dnd基因斑馬魚；將F1代轉(zhuǎn)基因GAL4斑馬魚自交，在F2代中獲得轉(zhuǎn)GAL4基因斑馬魚純合子；將F1代轉(zhuǎn)UAS?antisense?dnd基因斑馬魚自交，在F2代中獲得轉(zhuǎn)UAS?antisense?dnd基因斑馬魚純合子；（3）轉(zhuǎn)基因魚雜交：以轉(zhuǎn)GAL4基因斑馬魚純合子和轉(zhuǎn)UAS?antisense?dnd基因斑馬魚純合子為親本，進(jìn)行兩個(gè)家系的轉(zhuǎn)基因魚雜交，兩個(gè)家系雜交產(chǎn)生的后代魚生殖敗育。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種控制魚類生殖的方法，其步驟是: (1)外源基因?qū)?采用顯微注射法將重組基因CMV-eGFP-SV40-CMV-Gal4-SV40和CMV-RFP-SV40-UAS-antisense /分別導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，得到PO代轉(zhuǎn)GAL4基因斑馬魚和轉(zhuǎn)例基因斑馬魚； 所述的重組基因CMV-eGFP-SV40-CMV-Gal4-SV40，其序列為SEQ ID N0.1所示； 所述的重組基因 CMV-RFP-SV40-UAS-antisense /，其序列為 SEQ ID N0.2 所示； (2)獲得轉(zhuǎn)基因魚純合子:表達(dá)綠色...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：胡煒，張運(yùn)生，戴軍，朱作言，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院水生生物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：