本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種用于弓形蟲(chóng)感染預(yù)防的免疫佐劑，它是以pVAX1質(zhì)粒作為載體、融合白細(xì)胞介素IL21和IL15的重組質(zhì)粒pVAX-IL21-IL15，其堿基序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供的用于弓形蟲(chóng)感染預(yù)防的免疫佐劑具有顯著提升MIC8基因免疫效果的作用，進(jìn)而，能夠顯著增強(qiáng)弓形蟲(chóng)免疫預(yù)防疫苗的免疫效果。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種免疫佐劑，具體地，涉及一種用于弓形蟲(chóng)感染預(yù)防的免疫佐劑及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
弓形蟲(chóng)廣泛寄生于多種哺乳動(dòng)物的有核細(xì)胞內(nèi)，是一種重要的人獸共患性寄生蟲(chóng)病病原，具有發(fā)病率高、危害嚴(yán)重的流行病學(xué)特點(diǎn)。嬰幼兒、孕婦或免疫低下者感染，可引發(fā)流產(chǎn)、畸胎或急性獲得性弓形蟲(chóng)病等。艾滋病又名獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，研究發(fā)現(xiàn)10% 30%艾滋病患者并發(fā)弓形蟲(chóng)腦炎，是艾滋病患者死亡的主要原因之一。鑒于藥物治療弓形蟲(chóng)病能力有限且毒副作用大的特點(diǎn)，研制疫苗尤其是DNA疫苗已逐漸成為一種較為有效的舉措。從1990年WolfT等發(fā)現(xiàn)小鼠肌注外源性重組質(zhì)粒，質(zhì)粒被攝取并表達(dá)出編碼蛋白時(shí)起，重組質(zhì)粒的數(shù)量和種類(lèi)已舉不勝舉，其中近些年，弓形蟲(chóng)重組質(zhì)粒包括R0P13，ROP16, R0P18，MIC6，MIC8等先后被評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除少數(shù)個(gè)別基因(如R0P18等)免疫效果較好外，其他重組疫苗均有不理想的特征。為了增強(qiáng)免疫效果，提高免疫保護(hù)率，免疫佐劑的研制將成為一個(gè)重要的研究課題。按照是否具有免疫原性，免疫佐劑可分為兩大類(lèi)，即具備免疫原性的佐劑如卡介苗，細(xì)胞因子等，和不具備免疫原性的佐劑如鋁鹽佐劑等，或兩者的混合形式。其中，白細(xì)胞介素(IL)是一種常見(jiàn)的免疫佐劑。IL15是Grabstein于1994年從猿腎上皮細(xì)胞系CV-1/EBNA的培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)的，它是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，屬于IL2家族，主要由單核細(xì)胞、吞噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等白細(xì)胞產(chǎn)生，能維持依賴(lài)IL-2的CTLL細(xì)胞系的增殖，同時(shí)對(duì)⑶8+ T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的發(fā)育及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。IL15分子包含Cys-35-Cys-85和Cys-42-Cys-88兩個(gè)二硫鍵，三級(jí)結(jié)構(gòu)含有4個(gè)螺旋和3個(gè)連接環(huán)。IL15受體(IL15R)由3個(gè)亞基組成，β、Y亞基與IL2R相同，α亞基為IL15獨(dú)有。在慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)中，IL15引起由IgM交叉耦合 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，還可增加Shc和ERK1/2的磷酸化作用，而IL21促進(jìn)細(xì)胞凋亡且不能引起CLL細(xì)胞的增殖。IL21是Parrish-Novak首次發(fā)現(xiàn)的,屬于I型細(xì)胞因子,亦是IL-2家族成員。人IL21基因與IL2、IL15定位于同一條染色體上，位于4q26_q27，距IL-2基因大約180 kb,相距IL15則較遠(yuǎn)，與IL2、IL4、IL15有較高的同源性，鼠IL21與人的IL21有57%的同源性。IL21包含4個(gè)螺旋，與IL15有兩對(duì)相同的Cys位點(diǎn)殘基:一對(duì)是在IL21和IL15中特有的，另一對(duì)在IL2、IL4和GM-CSF中也有表達(dá)。IL21具有很強(qiáng)的免疫刺激作用，特別是能夠增強(qiáng)并維持CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答，已經(jīng)被證明是很好的免疫增強(qiáng)因子。IL21的信號(hào)傳導(dǎo)是由IL21受體與IL2受體家族共同的Y c受體組成的異二聚體受體介導(dǎo)的。IL21是啟動(dòng)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的輔助細(xì)胞因子，并導(dǎo)致免疫應(yīng)答進(jìn)一步放大。IL21對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，它可調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞的分化和增殖，其中最顯著的特征是能持續(xù)增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞及活化NK細(xì)胞的功能，在促進(jìn)機(jī)體由先天性免疫向獲得性免疫的轉(zhuǎn)變中起著關(guān)鍵作用。IL21對(duì)B細(xì)胞的調(diào)節(jié)主要表現(xiàn)為促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)免疫球蛋白的產(chǎn)生。IL21具有增強(qiáng)免疫激活、促進(jìn)CTL應(yīng)答和維持記憶性T細(xì)胞應(yīng)答的能力，使其成為癌癥免疫治療最具潛力的候選藥物之一。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供了一種用于弓形蟲(chóng)感染預(yù)防的免疫佐劑及其應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)提供了如下的技術(shù)方案: 一種用于弓形蟲(chóng)感染預(yù)防的免疫佐劑，它是以PVAXl質(zhì)粒作為載體、融合白細(xì)胞介素IL21和IL15的重組質(zhì)粒pVAX-1L21-1L15，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。本專(zhuān)利技術(shù)的用于弓形蟲(chóng)感染預(yù)防的免疫佐劑在提升MIC8基因免疫效果中的應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)的用于弓形蟲(chóng)感染預(yù)防的免疫佐劑在增強(qiáng)弓形蟲(chóng)免疫預(yù)防疫苗效果中的應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)的用于弓形蟲(chóng)感染預(yù)防的免疫佐劑在制備弓形蟲(chóng)免疫預(yù)防疫苗中的應(yīng)用。以下為本專(zhuān)利技術(shù)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容: 參照弓形蟲(chóng)MIC8基因序列，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增弓形蟲(chóng)MIC8基因的引物序列。包括:Fmic8:5/ -CGCGGATCCATGAAGGCCAATCGAATATGGTG-3'；Rmic8:5/ -CCGCTCGAGTTAGGACCAGATACCGCCCGAA-3'； 參照小家鼠(ifes musculus) IL15基因序列，設(shè)計(jì)了 IL15基因引物序列。包括:F15b:5/ -AACTGCAGATGAACTGGATAGATGTAAGATATG-3,；R15b:5/ -TGCTCTAGATCAGGACGTGTTGATGAAC-3/ ； 參照小家鼠(ifes musculus、IL21基因序列，設(shè)計(jì)了 IL21基因引物序列。包括:F21:5/ -CGGGGTACCATGCATAAATCAAGCCCCCAAG-3'；R21:5/ -AACTGCAGCTAGGAGAGATGCTGATGAATC-3,； 弓形蟲(chóng)RH株pVAX-MIC8疫苗的制備； KM鼠pVAX-1L21-1L15免疫佐劑的構(gòu)建； KM鼠免疫與分組。(一)弓形蟲(chóng)RH株P(guān)VAX-MIC8疫苗的制備包括如下順序的步驟: 1.蟲(chóng)體基因組DNA的提取:弓形蟲(chóng)RH株腹腔接種KM鼠96 h后，經(jīng)頸椎脫臼致死，無(wú)菌收集小鼠腹水1.0mL, IOOOOrpm離心3 5min，棄上清，備用。弓形蟲(chóng)RH株DNA提取的具體方法和步驟參照 Promega 公司試劑盒 Wizard SV Genomic DNA Purification System 使用說(shuō)明進(jìn)行。擴(kuò)增:以所提取的弓形蟲(chóng)RH株基因組DNA為模板，進(jìn)行MIC8基因的PCR擴(kuò)增。MIC8基因PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性 lmin，62°C復(fù)性Imin ;72°C延伸2min ；35個(gè)循環(huán)。純化產(chǎn)物的連接:MIC8 基因PCR純化產(chǎn)物的連接反應(yīng)參照TaKaRa公司pMD18_TVector使用說(shuō)明進(jìn)行。16°C反應(yīng)2 4h或4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物標(biāo)記為pMD18_MIC8。的序列測(cè)定:將經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定均為陽(yáng)性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司測(cè)序。質(zhì)粒的小量提取:按天根生化科技(北京)有限公司TIANprep Mini Plasmid Kit使用說(shuō)明進(jìn)行。載體(圖6所示)及MIC8目的片段的回收:用BamHI和XhoI分別雙酶切pVAXl質(zhì)粒及pMD18-MIC8重組質(zhì)粒，按照天根生化科技(北京)有限公司普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的使用說(shuō)明回收載體及目的片段。載體及MIC8目的片段的連接:將經(jīng)切膠回收純化得到的MIC8基因片段定向亞克隆至pVAXl載體中。16°C反應(yīng)4 6h或4°C連接過(guò)夜，產(chǎn)物標(biāo)記為pVAX_MIC8。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與鑒定:將連接產(chǎn)物10 μ L轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a中，挑取若干單菌落作菌液PCR鑒定。pVAX-MIC8構(gòu)建路線參照附圖說(shuō)明圖1。(二)KM 鼠 pVAX-1L21-1L15 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 1.KM本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于弓形蟲(chóng)感染預(yù)防的免疫佐劑，其特征在于，它是以pVAX1質(zhì)粒作為載體、融合白細(xì)胞介素IL21和IL15的重組質(zhì)粒pVAX?IL21?IL15，其堿基序列如SEQ?ID?NO:?1所示。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于弓形蟲(chóng)感染預(yù)防的免疫佐劑，其特征在于，它是以PVAXl質(zhì)粒作為載體、融合白細(xì)胞介素IL21和IL15的重組質(zhì)粒PVAX-1L21-1L15，其堿基序列如SEQ ID ...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱興全，李中原，陳佳，徐民俊，周東輝，黃思揚(yáng)，宋慧群，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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