本發明專利技術涉及疫苗學領域，具體的說是一種鰻弧菌重組蛋白的應用。鰻弧菌重組鞭毛蛋白FlaE作為非特異性免疫疫苗佐劑的應用。重組鞭毛蛋白FlaE構建過程為以鰻弧菌C312為模板，采用PCR擴增鞭毛蛋白基因,PCR產物與載體pET259連接，獲質粒pEFlaE，將其轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得表達鞭毛蛋白的菌株BL21/pEFlaE，通過親和層析純化獲得重組鞭毛蛋白。本發明專利技術的鰻弧菌鞭毛蛋白作為佐劑可提高疫苗的保護效應至20％以上。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及疫苗學領域，具體的說是一種鰻弧菌重組蛋白的應用。
技術介紹
國際水產養殖業的發展表明疫苗是養殖魚類病害防控最為有效的措施之一。目前魚類疫苗主要包括滅活疫苗、重組亞單位疫苗、核酸疫苗、減毒疫苗等類型，其中亞單位疫苗的應用通常需要免疫佐劑。疫苗佐劑是非特異性的免疫因子/試劑，其主要功能是協助疫苗刺激免疫系統產生反應，從而增強疫苗誘發的特異性免疫保護效應。研究表明細菌的鞭毛蛋白能夠通過與Toll樣受體結合而激活天然免疫系統，因此具有免疫佐劑的潛能。鰻弧菌(Vibrio anguillarum)屬于`革蘭氏陰性菌,是弧菌病的誘發因子。鰻弧菌表達5個鞭毛蛋白，即FlaA，FlaB，FlaC，FlaD，和FlaE，但這些鞭毛蛋白的免疫效應尚不清楚。我們在前期研究中發現鰻弧菌鞭毛蛋白FlaE能夠顯著提高亞單位疫苗的免疫保護效應，因此具有良好的疫苗佐劑功能。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供一種鰻弧菌重組蛋白的應用。為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案為一種鰻弧菌重組蛋白的應用，鰻弧菌重組鞭毛蛋白FlaE作為非特異性免疫疫苗佐劑的應用。所述鰻弧菌重組鞭毛蛋白FlaE重組過程為，以鰻弧菌C312為模板，采用EF/ER為引物進行PCR擴增，PCR產物與載體PET259連接，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α，篩選質粒pEFlaE，質粒pEFlaE轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，即得到鞭毛蛋白FlaE ;所述引物為FE :5’_CCCGGGATGGCAATTACCGTTAATAC-3’ ；RE :5’ -CCCGGG GCGAAGTAAGGCCAATG-3’。本專利技術具有如下優點本專利技術的鰻弧菌鞭毛蛋白作為佐劑可提高疫苗的保護效應至20%以上。附圖說明圖1為本專利技術實施例提供的純化的鞭毛蛋白(泳道2)。泳道1，分子量標準。具體實施例方式下面結合實施例對本專利技術作進一步說明。實施例旨在對本專利技術進行舉例描述，而非以任何形式對本專利技術進行限制。在本專利技術實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法1.質粒提取、DNA(PCR)產物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應試劑盒。 2.質粒、DNA連接液轉化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)；3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自于“北京，紐英倫生物技術有限公司”。實施例1鰻弧菌鞭毛蛋白為序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示(參見序列表I)。序列表IMAITVNTNVSALIAQRHLGSASEMLNQSLERLASGKRINSAKDDAAGLQISNRLESQMRGLDVAVRNANDGISIMQTAEGAMQETTSLLQRMRDLSLQSANGAN·SKADRQALQEEMGALNDELNRIAETTSFGGRKLLNGSFGQSSFQIGASSGEAVQVSLKNMRSDSLDMGGFSYVAAGMADSQWRVTQDNRQLTMSYTDAKGKQHNIQIQAKVGDDIEELATYINGQTDKVSASVNDKGQLQLFMAGKETSGTIDFKGSLANQLQMNVTGYEAVDTLDITEVGGAQRAVAVIDTAMQYVDSHRSELGALQNRFNHAINNLDNVHENLASSNSRIKDTDYAKETTQMVKQQILQQVSTSILAQAKKQPNLALALLR(a)序列特征 長度377 類型氨基酸序列籲鏈型單鏈 拓撲結構線性(b)分子類型蛋白質(C)假設否(d)反義否Ce)最初來源鰻弧菌C312(f)特異性名稱鞭毛蛋白FlaE結構特征該蛋白具有一個Flagellin_N結構(氨基酸5 — 143),—個Flagellin_IN結構(氨基酸194-249)和一個Flagellin_C結構(氨基酸291-376)。鰻弧菌鞭毛蛋白表達載體的構建方法質粒pEFlaE的構建以鰻弧菌C312為模板，采用FE/RE為引物進行PCR擴增鰻弧菌鞭毛蛋白FlaE基因(該基因序列已被報道。具體參見 Naka H, Dias GM, Thompson CC, Dubay C, Thompson FL, Crosa JH. Completegenome sequence of the marine fish pathogen Vibrio anguillarum harboring thepJMl virulence plasmid and genomic comparison with other virulent strainsof V. anguillarum and V. ordali1.1nfect Tmmun 2011;79:2889 - 900)。PCR 條件為94° C 60s 預變性模板 DNA，然后 94。C 40s，50。C 60s, 72° C 60s，5 個循環；然后94° C 40s, 62。C 60s, 72° C 60s, 25 個循環后再在 72。C 延伸反應 lOmin。PCR 產物用天根DNA產物純化試劑盒純化。將載體pET259 (pET259構建過程參見Zheng, W.J.,Hu,Y.H. , Sun, L. , 2010. Cloning and analysis of a ferritin subunit fromturbot (Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish. Tmmunol. 28, 829 - 836)用 SwaI 酶切后回收5. 4kb片段，將其與上述純化的PCR片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 — 4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α，在含卡那霉素(30ug/mL)的LB培養基上培養18 — 24小時，篩選轉化子提取質粒，即為質粒pEFlaE。所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水；所述鰻弧菌C312保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為=CGMCC No. 6250，保藏日期2012. 6. 21，分類命名為鰻弧菌(Vibrioanguillarum)，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號。所述引物為FE :5’ -CCCGGGATGGCAATTACCGTTAATAC-3’ 和 RE :5， -CCCGGGGCGAAGTAAGGCCAATG-3，。實施例2鞭毛蛋白的誘導表達和純化將上述的質粒pEFlaE用常規方法轉化大腸桿菌BL21(DE3)(購自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(30ug/mL)的LB固體培養基上培養18 - 24小時，挑取一個轉化子，將其命名為BL21/pEFlaE。將BL21/pEFlaE于含有卡那霉素(30ug/mL)的LB液體培養基中過夜培養；取ImL過夜后的培養液，加入IOOmL新鮮的含有卡那霉素(30ug/mL)的LB液體培養基中，于37° C下轉速200rpm搖動培養至OD6tltl為O. 6，加入終本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種鰻弧菌重組蛋白的應用，其特征在于：鰻弧菌重組鞭毛蛋白FlaE作為非特異性免疫疫苗佐劑的應用。
【技術特征摘要】
1.一種鰻弧菌重組蛋白的應用，其特征在于鰻弧菌重組鞭毛蛋白FlaE作為非特異性免疫疫苗佐劑的應用。2.按權利要求1所述的鰻弧菌重組蛋白的應用，其特征在于所述鰻弧菌重組鞭毛蛋白FlaE重組過程為，以鰻弧菌C312為模板，采用EF/ER為引物進行PCR擴增，PCR產物與載體pET259連接...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫黎，賈盼盼，胡永華，
申請(專利權)人：中國科學院海洋研究所，
類型：發明
國別省市：
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