本發明專利技術公開了一種富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的方法。本發明專利技術涉及分析化學領域特別是樣品前處理的方法。本發明專利技術先通過樣品預處理，再加入表面修飾有磺酸基的聚苯乙烯超順磁納米或亞微米磁球吸附，洗脫，收集洗脫液。洗脫溶液可直接用于液相色譜-質譜聯用定量分析克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的含量。本發明專利技術方法具有操作流程簡單、提取回收率高、洗脫溶劑用量少、無需旋蒸的特點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分析化學中樣品前處理領域，具體是涉及一種以磺酸基修飾的聚苯乙烯磁球富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的方法。
技術介紹
克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇為苯乙醇胺類化合物，屬于β_受體激動劑類藥物，可促進動物如牛、豬、羊、家禽等生長，并增強體內的脂肪分解代謝，顯著提高瘦肉率。所以自20世紀80年代以來，β -受體激動劑被大量添加于飼料中，以促進家畜生長和提高瘦肉率。β -受體激動劑易在動物組織，特別是內臟中蓄積殘留，其通過食物鏈進入人體后可引發肌肉震顫、心律失常、頭痛等癥狀，嚴重者可能危及生命。鑒于以上原因，我國已于1997將克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等列為禁止在飼料和養殖家畜飲用水中使用的藥品。但是目前仍有養殖者將其違法使用在畜牧業中，引發藥物殘留，從而對消費者健康造成嚴重損害。目前檢測活體動物排泄尿樣中β_受體激動劑殘留是判斷動物飼養過程中是否添加受體激動劑的有效手段之一。當前，在所有β_受體激動劑中，克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等是最為常用的三種受體激動劑。針對克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等造成的養殖家畜源性食品安全問題，建立尿樣中中痕量克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺的快速、簡便的分離富集方法，對提高定量檢測的靈敏度以及準確性，具有重要意義。目前，在痕量分析物的食品安全檢測分析中，有將近一半的誤差來源于樣品的前處理，而真正來源于儀器檢測的誤差還不足三分之一，且近70%的工作量都耗費在樣本的前處理階段。因此，發展快速、`高效的樣品前處理方法，對痕量分析物進行高效快速富集后再檢測，是減少痕量分析物檢測誤差、縮短檢測時間的有效手段。現有的養殖家畜尿樣中中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的提取、凈化方法主要參照中華人民共和國農業部行業標準(農業部1063號-3-2008文件)執行，文件中規定了養殖家畜尿樣中11種β_受體激動劑殘留量液相色譜-串聯質譜法測定的具體流程。其中樣品前處理步驟如下:取澄清養殖家畜尿樣5 mL，添加內標工作液100 μ (含克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D9和沙丁胺醇-D9各100 Pg/mL)，充分混勻。5 mol/L氫氧化鈉調節溶液pH至9-10，加叔丁醇-叔丁基甲醚(6:4)提取液10 mL，充分震蕩，7000 r/min離心10min，移取上清，重復提取一次，合并上清，旋轉蒸干(40°C)。0.2%甲酸水溶液溶解后過混合型強陽離子柱。與本專利技術方法相比，現有農業部行業標準樣品前處理流程相對較長，包括兩次提取凈化以及旋轉蒸干等步驟。而本方法僅需簡單地調整一次尿樣PH值即可。
技術實現思路
本專利技術目的提供了一種更為簡便和快速有效的養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇高效富集的方法。本專利技術中所米用的技術屬于磁分散固相萃取技術范疇，磁固相萃取(MagneticSolid Phase Extraction, MSPE)是一種以表面功能化的磁球(Magnetic Beads, MBs)為吸附劑的新型固相萃取方法。原理見圖1，該磁球以超順磁性納米四氧化三鐵為核，經非磁性聚合物材料包裹而成。通過在磁球表面修飾不同的化學功能團對目標物進行吸附。該方法結合了磁分離的簡便性與分散固相萃取吸附的高效性，采用分散固相萃取模式，克服了傳統固相萃取中過柱操作的缺點(如過柱耗時長、易堵塞、流速太快可造成的吸附效率下降，以及裝柱時吸附劑填裝不均勻密實產生的短路等問題)；同時由于磁球粒徑介于納米和亞微米之間，比表面積遠大于固相萃取材料(固相萃取材料粒徑范圍一般為20-100 μ m之間)，吸附容量大，吸附劑用量少，可實現微量洗脫液洗脫，富集倍數高，且可省去常規前處理流程中的旋轉蒸發等濃縮步驟；納米材料在溶液中具有良好的單分散性，在溶液中可均勻分布，比表面積大，提高了萃取過程中吸附劑吸附待分離物的速率，縮短了吸附時間；同時可在短時間內處理大體積樣品，有利于通過加大樣品處理量來增加富集系數，降低檢測限。具體來說本專利技術的技術方案包含下列步驟: (1)樣品處理:取尿樣5 10mL，調節尿樣pH至5 7; (2)吸附:加入適量磺酸基修飾的聚苯乙烯磁球，混勻，充分·吸附，磁場分離磁球，棄去上清； (3)洗脫收集:加200-800μ 洗脫溶劑將磁球上的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇洗脫，分離磁球，收集洗脫液；其中洗脫溶劑為含5%氨水的甲醇或乙醇溶液(即100份洗脫溶劑中95份為甲醇或乙醇，5份為氨水)。樣品可以使用牛、豬、羊、馬等養殖養殖家畜的尿樣。加入的磁球數量從節約材料角度以能充分吸附尿樣中的目標物為準。分離磁球可以采用常規的磁力架分離或者通過離心分離磁球等方法。聚苯乙烯超順磁磁球表面修飾有磺酸基功能團(見圖2)，通過磺酸基等作用將目標物吸附，為了達到更好的富集效果，磺酸基修飾磁球粒徑為7(T300 nm ;該范圍的磁珠能更好的在溶液中分散，當然在此粒徑范圍之外的磁珠也能達到富集的作用。本專利技術還涉及到上述富集方法在養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的分析檢測中應用，只需收集洗脫液，過濾后直接進行液相或者液相色譜-質譜聯用定量分析。過濾可以直接采取常規液相或液質聯用進樣所需的0.45 ym或0.22ym濾膜過濾，液相色譜或液相色譜-質譜聯用的條件可以直接采取隱色孔雀石綠和隱色結晶紫分析條件，此為常規實驗技術，不再贅言。粒徑范圍在70-300 nm的磺酸基修飾的聚苯乙烯磁球可以按照如下步驟制備:一步法合成磺酸基修飾聚苯乙烯磁性微球(粒徑范圍在70-300 nm):化學共沉淀法合成超順磁性Fe3O4納米單顆粒，再將Fe3O4納米顆粒表面油酸化，無水乙醇洗滌后氮氣吹干；取5g表面油酸化的Fe3O4納米顆粒,用體積比15:1的苯乙烯-十六燒混合液5 mL懸浮Fe3O4納米顆粒，超聲5 10 min形成磁流體，將磁流體轉入400 mL, 0.0lM含0.2 0.5%的SDS的NaHCO3溶液中，超聲波頻率為25KHz，超聲功率為200-300 W條件下繼續超聲乳化30min，形成細乳液；加0.1g K2S2O8于70°C反應2(T40 min后加入0.5 g乙烯基磺酸鈉，繼續反應12 h ;磁架吸附磁球，即獲得內含超順磁性Fe3O4納米單顆粒，表面修飾有磺酸基的磁球，磁球粒徑大小與溶液中SDS含量以及超聲功率成反比；磁架回收磁球，制備好的磺酸化磁球依次采用飽和食鹽水、3% NaOH以及3% HCl浸泡洗滌各I 3 h，最后以0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液洗滌磁球至中性，并將磁球重懸于0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液中于4°C保存備用。采用上述制備方法，可以使得磁球具有穩定性好、重現性好的優點。磺酸基修飾的聚苯乙烯磁球可以還按照如下步驟制備: 以羧基化聚苯乙烯磁性微球為原料:將表面羧基修飾的商品化聚苯乙烯磁球分散于pH4.0-5.0硼酸鹽緩沖液中，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺以活潑酯法活化磁球上的羧基；取上述表面羧基被活化后的磁球，加入5^20倍于磁球表面羧基密度的對氨基苯磺酸溶液，溶液PH調至8.(T9.0,室溫下振蕩反應2 4 h ;磁架回收磁球，制備好的磺酸化磁球依次采用飽和食鹽水、3% Na本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的方法，其特征在于包含以下步驟：（1）樣品處理：取尿樣5~10?mL，調節尿樣pH至5~7；（2）吸附：加入適量磺酸基修飾的聚苯乙烯磁球，混勻，充分吸附，磁場分離磁球，棄去上清；?（3）洗脫收集：加200?800?μL洗脫溶劑將磁球上的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇洗脫，分離磁球，收集洗脫液；其中洗脫溶劑為含5%氨水的甲醇或乙醇溶液。
【技術特征摘要】
2011.11.15 CN 201110361407.31.一種富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的方法，其特征在于包含以下步驟: (1)樣品處理:取尿樣5 10mL，調節尿樣pH至5 7; (2)吸附:加入適量磺酸基修飾的聚苯乙烯磁球，混勻，充分吸附，磁場分離磁球，棄去上清； (3)洗脫收集:加200-800μ 洗脫溶劑將磁球上的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇洗脫，分離磁球，收集洗脫液；其中洗脫溶劑為含5%氨水的甲醇或乙醇溶液。2.根據權利要求1所述的富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的方法，其特征在于步驟(2)中聚苯乙烯超順磁磁球表面修飾有磺酸基功能團，磺酸基修飾磁球粒徑為70 300 nm。3.根據權利要求1所述的富集方法，其特征在于每5mL尿樣所需磁球劑量為7.5-20mg ο4.根據權利要求1所述的富集方法在養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的分析檢測中應用，其特征在于收集洗脫液，過濾后直接進行液相或者液相色譜-質譜聯用定量分析。5.根據權利要求3所述的富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和...
【專利技術屬性】
技術研發人員：熊勇華，許恒毅，吳科盛，郭亮，梁語嫣，徐峰，賴衛華，
申請(專利權)人：南昌大學，
類型：發明
國別省市：
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