一種黃曲霉毒素B1液相色譜檢測用富集方法技術

本發明專利技術涉及一種黃曲霉毒素B1液相色譜檢測用富集方法，其特征在于：它包括以下步驟：（1）黃曲霉毒素B1富集材料的制備；（2）將上述制備的黃曲霉毒素B1富集材料加入待測樣品的甲醇水溶液中，所述體系中甲醇的含量按體積百分數計最高不超出體系總體積的12.5%，所述黃曲霉毒素B1富集材料的質量與體系總體積比至少要達到0.625g/mL，室溫混合，震蕩10-30min以進行黃曲霉毒素B1的富集，離心，去掉上清液，然后用甲醇進行洗脫，以將黃曲霉毒素B1富集材料中富集的黃曲霉毒素B1洗脫至甲醇中，得到含黃曲霉毒素B1的甲醇洗脫液，液相色譜檢測備用。該富集方法可用于黃曲霉毒素B1液相檢測時的富集處理，操作簡單，快速，結果可靠。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬生物檢測領域，具體涉及一種黃曲霉毒素B1液相色譜檢測用富集方法。
技術介紹
黃曲霉毒素是一類由黃曲霉和寄生曲霉分泌產生的高毒性次生代謝產物。自從I960年的“火雞事件”開始，人們開始關注黃曲霉毒素，現在發現的黃曲霉毒素(AFT)有十幾種，其中以黃曲霉毒素B1最常見、毒性最強。黃曲霉毒素廣泛存在于玉米、花生、棉籽、杏仁、無花果等農產品和食品中，加之其污染情況可以發生在產前、產中、產后的多個環節，使得其成為農業產業和食品安全的巨大威脅。為此世界各國建立各種標準對食品和農產品中黃曲霉毒素總量(黃曲霉毒素B:、ByG1和62的總量)和黃曲霉毒素B1的最大允許含量都做了強制性的規定。我國國標GB 2761-2011規定花生及其制品中黃曲霉毒素總量不得超過20 U g/kg，黃曲霉毒素B1含量不得超過5 yg/kg。因此對食品和農產品中黃曲霉毒素檢測方法的開發是目前科研人員的研究重點。 現有的黃曲霉毒素檢測方法主要有薄層層析法、液相色譜法、酶聯免疫法三種。薄層層析法作為傳統方法，因為需要操作人員長時間暴露在有機溶劑和毒素中而逐漸被淘汰。酶聯免疫分析法作為最新的分析方法，克服了薄層層析法對實驗人員傷害大的缺點，且檢測快速方便，在過去20年中發展迅速。但是這種方法涉及對溫度敏感性強的抗體，且通常一種抗體只能測定一種黃曲霉毒素，在多種黃曲霉毒素待檢的情況下，可能存在交叉反應而導致檢測結果不準，均制約了該方法的推廣和應用。所以，目前最能被大家認可的分析方法還是液相色譜分析法，它具有自動化程度高，定量定性準確，檢測種類多元的特點，一直是世界各國官方檢測方法。但是，目前針對黃曲霉毒素的高效液相色譜分析法均采用免疫親和柱來富集毒素，酶聯免疫分析法提及的抗體的缺點仍然無法避免，因此研究一種新的黃曲霉毒素B1富集方法以擺脫抗體的缺點，并使其能在黃曲霉毒素B1測中應用，對于監控食品和農產品中的黃曲霉毒素B1很重要的意義和應用價值。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題在于針對上述現有技術存在的不足，提供一種在黃曲霉毒素液相色譜檢測檢測中得以應用的黃曲霉毒素B1液相色譜檢測用富集方法。該富集方法可用于黃曲霉毒素B1液相色譜檢測時的富集處理，操作簡單，快速，結果可靠。本專利技術為解決上述技術問題采用的技術方案如下 一種黃曲霉毒素B1液相色譜檢測用富集方法，其特征在于它包括以下步驟 (I)黃曲霉毒素B1富集材料的制備 在鱗片石墨中加入硫酸和磷酸組成的混酸及高錳酸鉀，進行初步氧化反應，然后通過水解反應形成膨脹的氧化石墨，后用雙氧水、鹽酸和去離子水依次多次洗滌純化得到氧化石墨，然后將純化后的氧化石墨通過高強度的超聲解離成單層氧化石墨烯，再經離心選取2000rpm離心30分鐘不沉降且在5000rpm離心30min沉降而得到的；(2)將上述制備的黃曲霉毒素B1富集材料加入待測樣品的甲醇水溶液中，所述體系中甲醇的含量按體積百分數計最高不超出體系總體積的12. 5%，所述黃曲霉毒素&富集材料的質量與體系總體積比至少要達到O. 625g/mL，室溫混合，震蕩10_30min以進行黃曲霉毒素&的富集，離心，去掉上清液，然后用甲醇進行洗脫，以將黃曲霉毒素B1富集材料中富集的黃曲霉毒素B1洗脫至甲醇中，得到含黃曲霉毒素B1的甲醇洗脫液，液相色譜檢測備用。按上述方案，所述步驟(2)的體系在需要時加水進行稀釋，以使體系中甲醇含量按體積百分數計最高不超出體系總體積的12. 5% ;所述待測樣品的甲醇水溶液用量為4-8mL。按上述方案，所述步驟(2)中黃曲霉毒素B1富集材料的質量與體系總體積比優選為 O.625-0. 75g/mL。按上述方案，所述步驟(2)體系中黃曲霉毒素B1的含量應在O. 8-100ng/mL范圍內，如超出，可對待測樣品的甲醇水溶液進行相應濃縮或稀釋處理后再進行富集。按上述方案，所述步驟(2)中甲醇洗脫步驟為將甲醇加入到富集了黃曲霉毒素B1 的黃曲霉毒素B1富集材料中，混勻，離心，收集上清液，即為含黃曲霉毒素B1的甲醇洗脫液。 按上述方案，所述步驟(2)中甲醇洗脫步驟還包括重復洗脫步驟，即在前述離心得到的沉淀中加入甲醇，混勻，離心，將得到的上清液和前述上清液合并，得到含黃曲霉毒素 B1的甲醇洗脫液。按上述方案，所述步驟(2 )還包括將甲醇洗脫液中的甲醇吹至近干后，加入三氟乙酸和正己烷衍生，然后加流動相進行定容，備用。按上述方案，所述黃曲霉毒素B1富集材料的制備中高錳酸鉀與鱗片石墨的質量比優選為6:1 ;硫酸和磷酸的體積比優選為9:1 ;所述的石墨在初步氧化過程中的質量分數優選為O. 709Γ0. 75%，在水解后的最終反應體系中的質量分數優選為O. 39ΓΟ. 375% ;所述的初步氧化反應條件優選為50°C攪拌反應12 48小時。按上述方案，所述步驟(I)中超聲功率為800W或以上，超聲時間為Ih或以上。上述步驟(I)中優選2000rpm離心30分鐘不沉降且在5000rpm離心30min沉降進行篩選，即可避免離心速率過低而可能篩選得到的氧化石墨烯片層可能太大或太厚，甚至可能還含有未氧化完全的石墨，進而導致其用于待測樣品中黃曲霉毒素B1的吸附效果不佳，又可避免離心速率過高而篩選得到的氧化石墨烯片層較小，而可能會導致最后脫附時黃曲霉毒素B1 g集材料洗脫不完全。該黃曲霉毒素B1富集方法黃曲霉毒素B1液相色譜檢測用富集的工作原理本專利技術方法通過大量研究實驗，采用合適的黃曲霉毒素B1富集材料，并確定體系中適當的甲醇含量范圍，黃曲霉毒素B1富集材料適當的用量和富集時間等參數范圍，而達到基于黃曲霉毒素&富集材料具有高比表面積和較好的吸附活性，可以直接吸附黃曲霉毒素，在含有黃曲霉毒素B1的一定含量的甲醇水溶液中較好地富集黃曲霉毒素B1的效果，同時由于黃曲霉毒素B1易溶于甲醇中，利用其在甲醇中溶解性高的特點用甲醇洗脫而將黃曲霉毒素B1從黃曲霉毒素B1富集材料中洗脫下來，達到液相色譜檢測用黃曲霉毒素B1富集的目的。本專利技術的有益效果(I)本專利技術提供的黃曲霉毒素B1液相色譜檢測用富集方法操作簡單，快速，結果可靠， 整個過程僅需30分鐘左右/樣次。(2)成本低廉，且可允許操作人員對批量樣品同時進行處理，易于推廣普及。(3)其中使用的黃曲霉毒毒素B1富集材料性能穩定。與抗體或免疫親和柱相比， 其不需要特別的存放條件，富集時也不需要其他特別的儀器輔助操作。(4)污染少，安全性高。該富集方法所涉及的有機試劑和其他有毒試劑少，大大減 少了對操作人員和環境的污染。具體實施方式實施例1黃曲霉毒素B1液相色譜檢測用富集方法中富集條件的確定(I)黃曲霉毒素B1富集材料的制備將3. Og鱗片石墨過325目篩后加入到400 mL硫酸和磷酸體積比為9:1的混和溶液 中，攪拌10分鐘，然后在混合物中緩慢加入18. Og高錳酸鉀，每次加入量不宜過多，避免反 應溫度超過20°C。待高錳酸鉀全部加完后，加熱到50°C攪拌反應12小時。反應結束后，讓 混合物自然冷卻到室溫，將其倒入IOOmL的冰水中，持續室溫攪拌O. 5小時，最后將質量分 數為30%的雙氧水逐滴加入反應體系到溶液轉變為亮黃色停止。靜置過夜，倒掉上清，用 IL質量分數為5%-10%的鹽酸洗本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種黃曲霉毒素B1液相色譜檢測用富集方法，其特征在于：它包括以下步驟：（1）黃曲霉毒素B1富集材料的制備：??在鱗片石墨中加入硫酸和磷酸組成的混酸及高錳酸鉀，進行初步氧化反應，然后通過水解反應形成膨脹的氧化石墨，后用雙氧水、鹽酸和去離子水依次多次洗滌純化得到氧化石墨，然后將純化后的氧化石墨通過高強度的超聲解離成單層氧化石墨烯，再經離心選取2000rpm離心30分鐘不沉降且在5000rpm離心30min沉降而得到的；（2）將上述制備的黃曲霉毒素B1富集材料加入待測樣品的甲醇水溶液中，所述體系中甲醇的含量按體積百分數計最高不超出體系總體積的12.5%，所述黃曲霉毒素B1富集材料的質量與體系總體積比至少要達到0.625g/mL，室溫混合，震蕩10?30min以進行黃曲霉毒素B1的富集，離心，去掉上清液，然后用甲醇進行洗脫，以將黃曲霉毒素B1富集材料中富集的黃曲霉毒素B1洗脫至甲醇中，得到含黃曲霉毒素B1的甲醇洗脫液，液相色譜檢測備用。

【技術特征摘要】
1.一種黃曲霉毒素B1液相色譜檢測用富集方法，其特征在于它包括以下步驟 (1)黃曲霉毒素B1富集材料的制備 在鱗片石墨中加入硫酸和磷酸組成的混酸及高錳酸鉀，進行初步氧化反應，然后通過水解反應形成膨脹的氧化石墨，后用雙氧水、鹽酸和去離子水依次多次洗滌純化得到氧化石墨，然后將純化后的氧化石墨通過高強度的超聲解離成單層氧化石墨烯，再經離心選取2000rpm離心30分鐘不沉降且在5000rpm離心30min沉降而得到的； (2)將上述制備的黃曲霉毒素B1富集材料加入待測樣品的甲醇水溶液中，所述體系中甲醇的含量按體積百分數計最高不超出體系總體積的12. 5%，所述黃曲霉毒素&富集材料的質量與體系總體積比至少要達到0. 625g/mL，室溫混合，震蕩10_30min以進行黃曲霉毒素&的富集，離心，去掉上清液，然后用甲醇進行洗脫，以將黃曲霉毒素B1富集材料中富集的黃曲霉毒素B1洗脫至甲醇中，得到含黃曲霉毒素B1的甲醇洗脫液，液相色譜檢測備用。2.根據權利要求1的黃曲霉毒素B1液相色譜檢測用富集方法，其特征在于所述步驟(2)的體系在需要時加水進行稀釋，以使體系中甲醇含量按體積百分數計最高不超出體系總體積的12. 5% ;所述待測樣品的甲醇水溶液用量為4-8mL。3.根據權利要求1的黃曲霉毒素B1液相色譜檢測用富集方法，其特征在于所述步驟(2)中黃曲霉毒素B1富集材料的質量與體系總體積比為0. 625-0. 75g/mL。4.根據權利要求1的黃曲霉毒素B1液相...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李培武，喻理，張奇，丁小霞，張文，馬飛，張兆威，
申請(專利權)人：中國農業科學院油料作物研究所，
類型：發明
國別省市：