一種免疫傳感器對黃曲霉毒素的檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種免疫傳感器對黃曲霉毒素的檢測方法，黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一種具有較強的致癌性、致畸性和強烈毒性的真菌毒素，對黃曲霉毒素進行準確而快速的分析是降低和避免黃曲霉毒素危害的最有效手段之一。采用紫外光譜、透射電鏡對制備的金/聚苯胺/石墨烯(Au/PANI/GN)復合納米材料進行表征，并且將該材料用于構建電化學免疫傳感器，采用循環伏安法，電化學交流阻抗法，方波伏安法對其進行表征，制備的電化學免疫傳感器對黃曲霉毒素B1進行檢測。實驗結果表明：構建的電化學免疫傳感器，對黃曲霉毒素的檢測具有良好的電化學活性，黃曲霉毒素的濃度與峰電流呈現良好的線性關系，其線性方程為y＝?0.177x+4.28。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于醫學領域，尤其涉及一種免疫傳感器對黃曲霉毒素的檢測方法。
技術介紹
電化學免疫傳感器的概述電化學免疫傳感器是免疫分析方法中一種常用的分析方法，是通過抗體與抗原之間的特異性結合識別作用，應用電極作為傳感的元件，形成具有免疫性復合物負載在電極表面，并對分析物進行定量檢測與研究。免疫傳感器具備很多優點，它具有檢測快速方便、靈敏度高、價格低廉、選擇性好、專一性強、適合聯機化在線檢測，并可實現實際樣品的檢測。迄今為止，免疫傳感器在環境檢查、臨床醫學和食品安全工業等等領域都有重要用途。黃曲霉毒素的概述黃曲霉毒素是一種具有較強的毒素，迄今為止，國際癌癥研究機構已將黃曲霉毒素列為致癌物質系列。常見的黃曲霉毒素種類有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2等十幾種結構相似的化合物，其結構特征為都含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮。黃曲霉毒素極易溶解在機溶劑中，如甲醇和氯仿等，不易溶于水。黃曲霉毒素會損害人體的器官，抑制人體的免疫機能，而且黃曲霉毒素中AFB1毒性是最大的，是對人類健康危害造成非常嚴重的一類霉毒素。黃曲霉毒素的檢測方法目前黃曲霉的檢測方法有薄層層析法、微柱層析法、高效液相色譜法、免疫學方法、電化學免疫檢測法。其中薄層層析法對樣品處理存在所需時間多，抗干擾能力弱；微柱層析法測定樣品是需要對樣品組分進行分離；采用高效液相色譜法測定黃曲霉毒素時，根據實驗所使用的化學試劑和處理途，對實驗結果會造成影響，技術水平要求相對較高；而電化學免疫檢測法操作簡便，檢測靈敏度好、選擇活性性好，更適合用于微量元素的檢測。石墨烯的概述石墨烯(Graphene，G)是一種新型碳納米材料，由單層碳原子排列堆積而成單層二維蜂窩狀晶體，具有結構穩定，電阻率極低，使得石墨烯具備了優良的導電性。迄今為止，經研究發現石墨烯表面呈惰性，化學穩定性較高，并且石墨烯之間存在較強的范德華力，容易產生聚集，很難溶于水及其他溶劑中。為了充分發揮石墨烯優良的性質，必須要對石墨烯進行表面的改性。通過引入特定官能團，可賦予石墨烯新的性質，進一步拓展它的應用領域。聚苯胺的概述聚苯胺(PANI)是近年來一個常用的導電聚合物，根據苯胺單體PANI具有良好的導電性、以及良好的穩定性，能使石墨烯的片層間隙增大，可以阻止石墨烯片層之間的團聚，將其用于電化學免疫傳感器領域，有利于構建的傳感器的電化學性能的提高。納米金概述金納米材料具有較高比表面積、高表面反應活性、高催化效率和強吸附能力等許多獨特的優點。納米金還具有很好的生物相容性，將其用于修飾電極制備電化學免疫傳感器不但可以提高電極的導電性，還可以有效的降低反應電位，所以有效的提高了電極的靈敏度和選擇性。因為納米金的生物相容性可以為生物分子提供生物適應性的微環境，保持了生物分子的活性，因此金納米材料修飾的電極不影響蛋白酶的活性。針對黃曲霉毒素具有較強的毒性，檢測要求相對較高，尋找出檢測黃曲霉毒素B1最簡單，耗費較少的方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種免疫傳感器對黃曲霉毒素的檢測方法，旨在解決
技術介紹
中存在的問題。本專利技術是這樣實現的，一種免疫傳感器對黃曲霉毒素的檢測方法，該免疫傳感器對黃曲霉毒素的檢測方法包括：將制備的Au/PANI/GN復合納米材料修飾在金電極表面，采用交流阻抗法、循環伏安法檢測電極的電化學性能；黃曲霉免疫傳感器構建，在金電極表面滴涂Au/PANI/GN納米雜化物，晾干成膜后孵育anti-AFB1，然后用牛血清蛋白溶液封閉非特異性活性位點，接著孵育一系列不同濃度的AFB1用于和抗體特異性識別，采用方波循環伏安法，對anti-AFB1的濃度和孵育時間進行條件優化、對緩沖溶液的pH和AFB1免疫反應時間進行優化，篩選最佳優化條件；采用交流阻抗法(EIS)和方波循環伏安法(SWV)，對不同濃度的AFB1進行定量分析測定。Au/PANI/GN制備方法包括：PANI/GN復合物的制備：取200μL苯胺溶于200mLCH2Cl2中，轉移至600mL反應瓶中作為底部有機層；將6.0mgGN和200mgFeCl3·6H2O均勻分散在200mLHCl溶液中超聲分散2h后加入26.5μLH2O2，將超聲分散2h后加入26.5μLH2O2的混合溶液緩慢移入有機溶液的上層，建立界面體系；在冰浴條件下反應48h后，收集上層溶液，用二次水離心清洗，最后將產物溶解在二次水中，超聲分散20min，即制得分散均勻的PANI/GN復合納米材料；不同配比的Au/PANI/GN復合納米材料的制備：取10mgPANI/GN加入燒杯中，超聲分散均勻，分別加入10mg、40mgHAuCl4.2H2O和14.705mg檸檬酸三鈉，加水至20mL，超聲分散均勻，逐滴加入冰浴的0.6mL0.1mol/LNaBH4攪拌12h后，二次蒸餾水離心清洗，分別得到反應原料中PANI/GN與氯金酸質量比為1:1和1:4的Au/PANI/GN納米雜化物，備用。黃曲霉毒素免疫傳感器的構建方法為：在金電極表面修飾7μLAu/PANI/GN復合你們材料溶液，室溫晾干；用二次蒸餾水清洗，室溫下晾干成膜，在電極表面滴涂10μL150μg/mLanti-AFB1溶液，在37℃下孵育40min；用二次蒸餾水清洗，繼續在電極表面滴涂10μL2.0％牛血清蛋白BSA溶液封閉非特異性活性位點，于37℃下孵育40min，清洗干凈；將一系列不同濃度的AFB1抗原用于和抗體的特異性識別，37℃孵育30min，二次蒸餾水清洗干凈，于4℃冰箱中存儲備用。對Au/PANI/GN復合納米材料的表征包括：采用紫外光譜對制備的材料進行表征、采用透射電鏡對不同金納米粒子負載率的Au/PANI/GN復合納米材料進行形貌表征。采用交流阻抗法、循環伏安法檢測電極的電化學性能方法中，以Fe(CN)63-/4-作為氧化還原探針，采用電化學交流阻抗法和循環伏安法，分析不同材料修飾電極在含有0.1MKCl的10.0mMFe(CN)63-/4-溶液中的循環伏安行為，掃描速率為100mV/s。anti-AFB1濃度的優化方法為：將7μLAu/PANI/GN修飾于金電極上，固載不同濃度的anti-AFB110μL25μg.mL-1、50μg.mL-1、100μg.mL-1、150μg.mL-1、200μg.mL-1將構建的傳感器進行孵育，采用方波伏安法檢測的電流響應隨濃度的變化篩選優化條件，anti-AFB1的最佳濃度為150μgmL-1；磷酸鹽緩沖溶液pH的優化方法為：首先，固定anti-AFB1的濃度為150μg.mL-1，優化不同pH，根據蛋白質的活性與溶液的pH的有聯系原理，底液的pH控制在5.0到8.0之間，測定不同pH溶液下電化學免疫傳感器反應的響應電流值，溶液的最佳pH為7.0；anti-AFB1孵育時間優化方法為：固定anti-AFB1濃度為150μgmL-1，分別孵育20min、30min、40min、50min、60min，在pH7.0PBS溶液中進行檢測，通過電流響應值與孵育時間的關系，對anti-AFB1孵育時間進行優化anti-AFB1的最佳孵育時間為50min；AFB1免疫時間的優化方法為：固定anti本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種免疫傳感器對黃曲霉毒素的檢測方法，其特征在于，該免疫傳感器對黃曲霉毒素(AFB1)的檢測方法包括：將制備的不同類型的納米材料修飾在金電極表面用于構建不同類型的電化學傳感器，采用交流阻抗法、循環伏安法檢測傳感器的電化學性能；黃曲霉毒素免疫傳感器的構建，先在金電極表面滴涂金/聚苯胺/石墨烯(Au/PANI/GN)復合納米材料，晾干成膜后孵育anti?AFB1，然后用牛血清蛋白溶液封閉非特異性活性位點，接著孵育一系列不同濃度的AFB1抗原用于和抗體特異性識別，采用方波循環伏安法對AFB1抗體的濃度和孵育時間進行條件優化、對緩沖溶液的pH和AFB1抗原免疫反應時間進行優化，篩選最佳條件；在最佳條件下采用交流阻抗法和方波循環伏安法，對不同濃度的黃曲霉毒素進行定量分析測定。

【技術特征摘要】
1.一種免疫傳感器對黃曲霉毒素的檢測方法，其特征在于，該免疫傳感器對黃曲霉毒素(AFB1)的檢測方法包括：將制備的不同類型的納米材料修飾在金電極表面用于構建不同類型的電化學傳感器，采用交流阻抗法、循環伏安法檢測傳感器的電化學性能；黃曲霉毒素免疫傳感器的構建，先在金電極表面滴涂金/聚苯胺/石墨烯(Au/PANI/GN)復合納米材料，晾干成膜后孵育anti-AFB1，然后用牛血清蛋白溶液封閉非特異性活性位點，接著孵育一系列不同濃度的AFB1抗原用于和抗體特異性識別，采用方波循環伏安法對AFB1抗體的濃度和孵育時間進行條件優化、對緩沖溶液的pH和AFB1抗原免疫反應時間進行優化，篩選最佳條件；在最佳條件下采用交流阻抗法和方波循環伏安法，對不同濃度的黃曲霉毒素進行定量分析測定。2.如權利要求1所述的免疫傳感器對AFB1的檢測方法，其特征在于，Au/PANI/GN制備方法包括：不同金負載率的Au/PANI/GN復合納米材料的制備：準確量取10mgPANI/GN于燒杯中，超聲分散，分別加入10mg、40mgHAuCl4·2H2O和14.705mg檸檬酸三鈉，加水至20mL，超聲分散，逐滴加入冰浴的0.6mL0.1mol/LNaBH4攪拌12h反應完全后，二次蒸餾水離心清洗，即可得到Au/PANI/GN復合納米材料，備用。3.根據權利要求2所述的Au/PANI/GN復合納米材料的制備中所用的氧化劑有硼氫化鈉、抗壞血酸。4.根據權利要求2所述的Au/PANI/GN復合納米材料的制備中，反應原料中PANI/GN與氯金酸的質量比分別為1:1和1:4。5.如權利要求1所述的免疫傳感器對AFB1的檢測方法，其特征在于，AFB1免疫傳感器的構建方法為：將拋光處理好的金電極在0.5MH2SO4中掃循環伏安直到電極穩定，晾干，在電極表面滴涂7μLAu/PANI/GN納米雜化物溶液，室溫晾干；用二次蒸餾水清洗，室溫下晾干成膜，在電極表面滴涂10μL150μg/mLanti-AFB1溶液，在37℃下孵育40min；用二次蒸餾水清洗，繼續在電極表面滴涂10μL2.0％牛血清蛋白BSA溶液封閉非特異性活性位點，于37℃下孵育40min，清洗干凈；將一系列不同濃度的AFB1抗原用于和抗體的特異性識別，37℃孵育30min，二次蒸餾水清洗干凈，于4℃冰箱中存儲備用。6.如權利要求1所述的AFB1的檢測中，AFB1的濃度分別為0.025ng/mL、0.05ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL。7.如權利要求1所述的免疫傳感器對AFB1的檢測方法，其特征在于，對Au/PANI/GN復合納米材料的表征包括：采用紫外光譜對制備的材料進行表征、采用透射電鏡對不同金納米粒子負載率的Au/PANI/GN復合納米材料進行形貌表征。8.如權利要求1所述的免疫傳感器對AFB1的檢測方法，其特征在于，采用交流阻抗法、循環伏安法表征傳感器的電化學性能中，以Fe(C...

【專利技術屬性】
技術研發人員：石玲，劉衛，王澤鋒，陳顯蘭，楊光明，茍高章，徐世娟，
申請(專利權)人：紅河學院，
類型：發明
國別省市：云南;53