一種同時檢測多種黃曲霉毒素傳感器的制備方法及應用技術

本發明專利技術公開了一種同時檢測多種黃曲霉毒素印刷電極電化學免疫傳感器的制備方法和應用，屬于生物傳感、納米功能材料及食品安全分析技術領域。本發明專利技術是在涂覆一層聚酯薄膜的矩形基片表面上印刷7個電極，其中包括5個碳工作電極，1個銀參比電極和1個對電極，7個電極引出線及引出線端部。其特征在于，用銀納米粒子—氮摻雜石墨烯—羥丙基殼聚糖導電復合納米材料將黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2以及總黃曲霉毒素的抗體固定到各工作電極表面，滴涂檢測液后與多通道電化學工作站檢測電路相連，從而實現了五種黃曲霉毒素的同時檢測。本發明專利技術制備簡單、加工方便、成本低、便于攜帶。該檢測方法簡單、快速、靈敏度高、特異性好。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物傳感、納米功能材料及食品安全分析
，具體是涉及一種同時檢測多種黃曲霉毒素傳感器的制備方法及應用。
技術介紹
黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產物，產生的黃曲霉毒素主要有黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素Gl和黃曲霉毒素G2 (簡稱4種黃曲霉毒素)，普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中，可通過多種途徑污染食品和飼料，直接或間接進入人類食物鏈，威脅人類健康和生命安全。黃曲霉毒素是到目前為止所發現的毒性最大的真菌毒素，其毒性相當于氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，長期攝入黃曲霉毒素會誘發肝癌，它誘發肝癌的能力比二甲基亞硝胺大75倍，是目前公認的致癌性最強的物質之一。在發展中國家食用被黃曲霉毒素污染的食物與癌癥的發病率呈正相關性，亞洲和非洲的疾病研究機構的研究工作表明，食物中黃曲霉毒素與肝細胞癌變呈正相關性，長時間食用含低濃度黃曲霉毒素的食物是導致肝癌、胃癌和腸癌等疾病的主要原因。國家衛生部門禁止企業使用被黃曲霉毒素嚴重污染的糧食進行食品加工生產，并制定相關的標準監督企業執行，但對于含黃曲霉毒素濃度較低的糧食和食品無法進行控制。因此開發出一種能同時快速靈敏檢測食品中多 種微量黃曲霉毒素的多通道印刷電極具有十分重要的意義。石墨烯，是已知材料中最薄的一種，且非常牢固堅硬；作為單質，它在室溫下傳遞電子的速度比已知導體都快，它具有超薄、強韌、穩定、導電性好等諸多現有材料無法比擬的優點。氮原子摻雜石墨烯，可改變材料性能。拉曼光譜表明，氮摻雜改變了石墨烯薄片的電子特性，但不會干擾它的基本結構。氮原子放在平面石墨烯片內，每個氮原子鍵合三個相鄰的碳，即每個氮原子取代薄片上的一個碳，可以制得高品質石墨烯，將其用于傳感器的制備，使傳感器的靈敏度和穩定性得到顯著提高，改善了傳感器的性能。殼聚糖在傳感器的自組裝過程中起到了非常好的作用，羥丙基殼聚糖是由殼聚糖改性而成的一種水溶性良好的殼聚糖衍生物，它既能溶于水又能溶于乙醇等有機溶劑，具有良好的乳化性、抗菌性、吸濕保濕性和表面活性，其吸濕保濕能力與透明質酸相當，乳化性和泡沫性與非離子表面活性劑TweeneO相當，其在傳感器中的效果優于殼聚糖。目前測定黃曲霉毒素的方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附測定法、質譜法、放射免疫測定法。存在以下不足: (1)檢測過程煩瑣、耗時長，勞動強度大； (2)儀器設備昂貴、操作復雜，難以實現快速分析； (3 )靈敏度較差，且不能實現多種黃曲霉毒素的同時檢測。針對上述不足，本專利技術提供一種操作方便、便攜、成本低、快速靈敏檢測食品中多種黃曲霉毒素的印刷電極電化學免疫傳感器。
技術實現思路
本專利技術的技術方案，包括以下步驟。1.一種同時檢測多種黃曲霉毒素傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)在一個涂覆一層聚酯薄膜的矩形基片表面上，依次以銀漿印刷I個參比電極，以導電碳漿印刷5個工作電極、I個對電極、7個電極引出線及引出線端部，并在所有電極及引出線端部以外的基片上，以絕緣漿印刷一層絕緣層，并在電極區域形成一個圓形電解池凹槽⑦，制得五通道絲網印刷電極； (2)在(I)所述的五通道絲網印刷電極的5個工作電極上，滴涂5 IOPL銀納米粒子一氮摻雜石墨烯一羥丙基殼聚糖的導電復合納米材料溶液；所述導電復合納米材料溶液，是將銀納米粒子與氮摻雜石墨烯按照一定的質量比進行混合超聲分散30min，然后加上質量分數1.0%的羥丙基殼聚糖溶液超聲混合30min，制成質量比為(I 5): (8 12): (Γ10)的銀納米粒子一氮摻雜石墨烯一羥丙基殼聚糖導電復合納米材料溶液；所述羥丙基殼聚糖溶液，將I g羥丙基殼聚糖加入到99 mL水中攪拌2 h，制得質量分數1.0%的羥丙基殼聚糖溶液。 (3)在步驟(2)制得的5個工作電極上分別滴加5 ΙΟμ 的黃曲霉毒素BI抗體、黃曲霉毒素Β2抗體、黃曲霉毒素Gl抗體、黃曲霉毒素G2抗體及總黃曲霉毒素抗體，再以ΙΟμ ，質量分數為1%的牛血清白蛋白封閉電極上的非特異性活性位點，制得一種同時檢測多種黃曲霉毒素傳感器，置于4 °C下保存備用，所述抗體濃度均5 10 Pg/mL。2.一種同時檢測多種黃曲霉毒素的方法，該方法包括以下步驟: (1)將黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素Gl和黃曲霉毒素G2(簡稱4種黃曲霉毒素)及總黃曲霉毒素的標準溶液分別滴涂到上述方法制備的一種同時檢測多種黃曲霉毒素傳感器對應的工作電極表面上，孵化2 3 h，然后用pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，得到修飾好的工作電極； (2)將參比電極、工作電極和對電極連接在多通道電化學工作站上，在電解槽中加入5mmol/L的鐵氰化鉀溶液，通過循環伏安法檢測所述修飾好的工作電極的電流響應； (3)根據所得電流響應與4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標準溶液濃度之間的關系，繪制工作曲線； (4)用待測樣品代替4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標準溶液，按照所述4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素工作曲線的繪制方法進行檢測，其檢測結果對照所繪制的4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素工作曲線，計算出樣品中4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的含量。所述一種同時檢測多種黃曲霉毒素的方法實現了 4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素共5種組分的同時測定。所述一種同時檢測多種黃曲霉毒素傳感器，所用原料均可以在化學試劑公司或生物制藥公司購買。與現有技術相比，本專利技術的優勢如下: (I)采用的印刷電極制備簡單、成本低、便于攜帶、易于微型化和集成化；(2)采用印刷電極制成傳感器，檢測方法簡單，靈敏度高、重現性好，應用范圍廣； (3)采用印刷電極制成傳感器，與多通道電化學工作站的檢測電路相連，能夠實現五種組分的同時檢測，更加方便快捷，且同步性好，能減小測量誤差； (4)采用印刷電極制成傳感器，采用免疫分析技術實現了不同種類黃曲霉毒素的特異性識別。附圖說明圖1是本專利技術的印刷電極結構示意圖。圖1中，①基片，②參比電極，③工作電極，④對電極，⑤電極引出線，⑥引出線端部，⑦圓形凹槽。圖2是圓形凹槽內電極工作區域結構示意圖。具體實施例方式 下面結合附圖和實例進一步說明本專利技術。實施例1本專利技術所述的一種同時檢測多種黃曲霉毒素傳感器的制備方法，結合圖1，步驟如下。在一個涂覆一層聚酯薄膜的矩形基片①表面上，依次以銀漿印刷I個參比電極②，以導電碳漿印刷5個工作電極③、I個對電極④、7個電極引出線⑤及引出線端部⑥，并在所有電極及引出線端部以外的基片上，以絕緣漿印刷一層絕緣層，并在電極區域形成一個圓形電解池凹槽⑦，制得一種五通道絲網印刷電極。實施例2本專利技術所述的一種同時檢測多種黃曲霉毒素傳感器的制備方法，結合圖1，步驟如下。(I)在實施例1制備的多通道印刷電極的5個工作電極上，滴涂5μ 銀納米粒子-氮摻雜石墨烯-羥丙基殼聚糖導電復合納米材料；所述導電復合納米材料中銀納米粒子和氮摻雜石墨烯的質量比為1: 8，超聲混合30min，加上羥丙基殼聚糖溶液超聲分散30min，制成質量比為1: 8:1的銀納米粒子一氮摻雜石墨烯一輕丙基殼聚糖導電復合納米材料溶液； (2)在步驟(I)制得的5個工作電極上分別滴加5μ 濃度為10 Pg/mL的4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的抗體，再以IOPL、質量分數為1%本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種同時檢測多種黃曲霉毒素傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）在一個涂覆一層聚酯薄膜的矩形基片（①）表面上，依次以銀漿印刷1個參比電極（②），以導電碳漿印刷5個工作電極（③）、1個對電極（④）、7個電極引出線（⑤）及引出線端部（⑥），并在所有電極及電極引出線端部以外的基片上，以絕緣漿印刷一層絕緣層，并在電極區域形成一個圓形電解池凹槽（⑦），制得五通道絲網印刷電極；（2）在（1）所述的五通道絲網印刷電極的5個工作電極上，滴涂5?~?10μL銀納米粒子—氮摻雜石墨烯—羥丙基殼聚糖構成的導電復合納米材料溶液；所述導電復合納米材料溶液，其特征是，將銀納米粒子和氮摻雜石墨烯一定的質量比進行混合超聲分散30min，然后加上質量分數1.0%的羥丙基殼聚糖溶液超聲混合30min，制成質量比為（1?~?5）:（8?~?12）:（1~?10）的銀納米粒子—氮摻雜石墨烯—羥丙基殼聚糖導電復合納米材料溶液；（3）在步驟（2）制得的5個工作電極上分別滴加5?~?10μL的黃曲霉毒素B1抗體、黃曲霉毒素B2抗體、黃曲霉毒素G1抗體、黃曲霉毒素G2抗體及總黃曲霉毒素抗體，再以10μL、質量分數為1%的牛血清白蛋白封閉電極上的非特異性活性位點，制得一種同時檢測多種黃曲霉毒素傳感器，置于4?℃下保存備用，所述抗體濃度均5?~?10?μg/mL。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：杜斌，魏琴，黎榮霞，于海琴，張勇，吳丹，李賀，馬洪敏，
申請(專利權)人：濟南大學，
類型：發明
國別省市：