本發明專利技術提供了一種“一步法PreS1抗原酶聯免疫測定試劑盒”，能非常專一地檢測患者血清中HBsAg-PreS1蛋白的濃度。該試劑盒是包括主要成分親和素預先包被后加入生物素化抗乙肝病毒PreS1單克隆抗體或抗HBS抗體的酶標板包被反應條、酶標記前S1抗體、陽性對照液一支、陰性對照液一支、20倍濃洗滌液1瓶、底物緩沖液甲1瓶、底物緩沖液乙1瓶及終止液(2NH2SO4)1瓶組成。本發明專利技術具有較好的均一性，特異性，靈敏度，采快速簡便，用一步法可在30分鐘左右獲得實驗結果，比PCR檢測法省時(PCR法最快需要6-8小時完成實驗)，經臨床試用PreS1蛋白檢測陽性與PCR檢測的HBV-DNA陽性有很好的符合率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬生物制劑
具體涉及一種一步法乙肝病毒前SI (PreSl)抗原(Ag)酶聯免疫測定試劑盒及制備方法。
技術介紹
我國屬于乙型肝炎病毒高發區，乙型肝炎已經成為危害我國人民身體健康的社會公眾性問題，乙型肝炎病毒血清標志物(HBVM)作為乙型肝炎病毒診斷的常規項目已不能滿足臨床，HBV-DNA、病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒前SI (PreSlAg)抗原都作為HBV在人體內感染和復制的證據。HBV為嗜肝DNA病毒，由一個不完全雙鏈DNA組成，約3200個氨基酸，有4個開放讀碼框為S區、C區、P區、X區。S基因區又可分成三段，從上游開始依次為前SI (preSl)區、前S2(preS2)區和S區。PreSl原具有較強的免疫原性，是由108或119個氨基酸組成。HBV以前SI區氨基酸21-47片段作為結合部位結合肝細胞，只要這一片段完好就有傳染性和高度的免疫源性。PreSl抗原出現在急性乙型肝炎病毒感染的最早期，比HbeAg出現早，是早期傳染性的標志。乙型肝炎病毒的大量復制，導致大量的PreSlAg表達，刺激機體產生較強的免疫應答，從而導致大量肝細胞損傷，并認為PreSl作為HBV的外殼蛋白成份，在HBV感染宿主細胞的過程中起著關鍵的作用，最重要的介導部位是前SI蛋白的氨基(AA)21-47片段，變異的病毒只要這一區段完好就有傳染性。PreSl在病毒感染機體的整個周期中，PreSl的獨特作用，使其能夠較充分的反應機體的體液免疫狀況，直至病程的轉陰過程，如急性肝炎時PreSlAg陰轉是病毒清除的最早跡象，反之，PreSlAg持續陽性，急性肝炎將發展至慢性肝炎。因此，PreSlAg與HBV-DNA在反映乙肝病毒復制有良好的一致性。PreSlAg較HBeAg更敏感地反映HBV復制的情況。但是目前普遍使用雙抗體夾心法檢測乙肝病毒PreSl抗原，具有很好的特異性，但是單純利用無力吸附吧單克隆抗體或者多克隆抗體吸附在酶標板上會存在單抗使用量大，活性損失大，特別是批間精密度差等缺點，而將親和素包被在板上，再加入生物素化的抗體，則可以很好的解決這一問題，其不但可以減少批間差，而且可以在檢測過程中可一步直接加入樣品血清和酶標記抗體進行反應，形成固相親和素-生物素話抗體-乙肝病毒PreSl抗原-酶標抗PreSl抗原抗體復合物，然后加入底物緩沖液甲和乙進行反應，就可以定量分析血清中的乙肝病毒PreSl抗原的含量。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題在于解決傳統酶標板批間差不足的問題，設計并建立了一步法PreSl抗原的檢測試劑盒。本專利技術提供了一種“一步法PreSl抗原酶聯免疫測定試劑盒”，該試劑盒是包括主要成分親和素預先包被后加入生物素化抗乙肝病毒PreSl單克隆抗體或抗HBS抗體的酶標板包被反應條、酶標記前SI抗體、陽性對照液一支、陰性對照液一支、20倍濃洗滌液I瓶、底物緩沖液甲I瓶、底物緩沖液乙I瓶及終止液(2N H2S04) I瓶組成。1、抗體制備(I)利用HBV-DNA重組PreSl Ag基因片段通過原核表達或者真核表達制備抗原；(2)制備抗體的制備和純化用上述重組抗原免疫豚鼠，得抗PreSl抗血清或免疫Balb/C小鼠得陽性鼠脾細胞與骨髓瘤；細胞融合成雜交瘤細胞，篩選陽性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進行純化，得純抗PreSl抗體，其純度95%以上。(3)用親和素先包被酶標板，并加入生物素標記的抗乙肝病毒PreSl單克隆抗體或抗HBS進行二次包被反應,制成抗體預包被反應條48-96孔；(4)辣根過氧化物酶(HRP)與純化的抗乙肝病毒PreSl抗體酶聯，制成酶標抗體；(5)配制陽性對照液、陰性對照液；(6)配制20倍濃縮洗液；(7)配制底物緩沖液甲；(8)配制底物緩沖液乙；(9)配制終止液(2N H2S04)。(10)分裝上述試劑盒除預報被板其余七種成分，按需要分裝在小瓶或尖底離心管中；(11)檢定試劑盒的特異性、靈敏度、精密性、穩定性合格；(12)組裝成成品。2、本專利技術的試劑盒在使用時可以如下操作(I)取出已包被條孔或板，恢復至室溫。(2)配液將濃縮洗滌液(20X)用蒸餾水或去離子水稀釋備用(20倍濃洗滌液lml+19ml蒸餾水即為工作液)。(3)加樣每孔加待檢血清50ul，各板設陽性對照一孔(50ul)，陰性對照一孔(50ul)，空白對照一孔(加蒸餾水50ul)，然后除空白對照孔外，各孔加酶標記液50ul，(4)溫育用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘。(5)洗滌小心揭掉封板膜，將孔內液體甩干，用洗滌液充分洗滌5遍，扣干。(6)每孔加入顯色液A、B各I滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘(7)測定OD值每孔加終止液I滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，設定酶免分析儀波長于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測)，測定各孔OD值。(8)結果判定陰性對照(A值)*2. 5 =臨界值(cut off值)，陰性對照高于O. 05時按實際OD值算，陰性對照小于O. 05按O. 05計算，凡待檢標本孔A值大于臨界值即為陽性。本專利技術的試劑盒能非常專一地檢測患者血清中HBsAg-PreSl蛋白的濃度。它具有簡便、靈敏和穩定等特點。且本試劑盒操作簡便快速，采用一步法可在30分鐘左右獲得實驗結果，比PCR檢測法省時(PCR法最快需要6-8小時完成實驗)，經臨床試用PreSl蛋白檢測陽性與PCR檢測的HBV-DNA陽性有很好的符合率，本試劑盒和PCR法相比，PCR需貴重的儀器設備，消耗性試劑昂貴，收費價又高，而本試劑盒整個實驗中無需貴重儀器設備，消耗性試劑便宜且收費價低廉，能適用于各級醫院及臨床測試中心，也可用于流行病學普查。一步法PreSl Ag試劑盒，具有簡便、靈敏、重復性好的優點，能檢出完整HBV，將可被普遍使用。具體實施例方式實施例11、制備一步法乙肝病毒前SI蛋白酶免試劑盒的生產步驟1、生物素化抗體制備(I)純化包被抗體(HBsAb):用重組抗原免疫豚鼠，得抗PreSl抗血清或免疫Balb/C小鼠得陽性鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞，篩選陽性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進行純化，得純抗PreSl抗體，其純度95%以上。效價大于10萬。(2)生物素偶聯抗PreSl抗體用常規方法將生物素(BNHS)溶于N，N_二甲基酰胺(DMF)配成lmg/Ml，用O.1mol/L pH值為9. O的NaHC03將純化的抗PreSl抗體稀釋成l_2mg/mL，按BNHS與抗體的容積比為1: 8或重量比為1: 7左右混合，室溫攪拌下反應2-4h，裝入透析對O. 05mol/LpH值為7. 2的PBS，4°C透析過夜，結合物加等體積的甘油，小量分裝，_20°C —下保存備用。2、酶標記抗體制備(I)抗體制備基因重組的PreSl Ag免疫豚鼠得抗PreSl抗體或重組的PreSl Ag免疫Balb/C小鼠得腹水，抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進行純化，得純抗PreSl抗體，其純度95%以上。效價大于10萬。(2)酶標記抗體制備抗PreSl抗體用過碘酸鈉法與辣根過氧化物偶聯(3)酶標記抗體濃度選定采用方陣滴定本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種“一步法乙肝病毒PreS1抗原酶聯免疫測定試劑盒”，其特征在于該試劑盒包括：(1)用親和素先包被酶標板，并加入生物素標記的前S1單克隆抗體或抗HBS進行二次包被反應，制成抗體預包被反應條48?96孔；(2)酶標記前S1抗體；(3)陽性對照液1支、陰性對照液1支；(4)20倍濃縮洗液1瓶；(5)底物緩沖液甲1瓶；(6)底物緩沖液乙1瓶；(7)終止液(4N?H2SO4)1瓶組成。
【技術特征摘要】
1.ー種“一歩法こ肝病毒PreSl抗原酶聯免疫測定試劑盒”，其特征在于該試劑盒包括 (1)用親和素先包被酶標板，并加入生物素標記的前SI單克隆抗體或抗HBS進行二次包被反應，制成抗體預包被反應條48-96孔； (2)酶標記前SI抗體； (3)陽性對照液I支、陰性對照液I支； (4)20倍濃縮洗液I瓶； (5)底物緩沖液甲I瓶； (6)底物緩沖液こI瓶； (7)終止液(4NH2S04) I瓶組成。2.—種如權利I所描述的ー種“ー步法こ肝病毒PreSl抗原酶聯免疫測定試劑盒”的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟 (1)利用HBV-DNA重組PreSlAg基因片段通過原核表達或者真核表達制備抗原； (2)制備抗體的制備和純化用上述重組抗原免疫豚鼠，得抗PreSl抗血清或免疫Balb/C小鼠得陽性鼠脾細胞與骨髄瘤細胞融合成雜交瘤細胞，篩選陽性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進行純化，得純抗PreSl抗體，其純度95%以上，效價大于10萬。(3)用親和素先包被酶標板，并加入生物素標記的抗こ肝病毒PreSl單克隆抗體或抗HBS進行二次包被反應，制成抗體預包被反應條48-96孔； (4)辣根過氧化物酶(HRP)與純化的抗こ肝病毒PreSl抗體酶聯，制成酶標抗體； ...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張年，
申請(專利權)人：武漢康珠生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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