豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒及其制備方法和其應用技術

本發明專利技術涉及一種豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒及其制備方法和其應用。其中，所述檢測試劑盒含有：包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的酶標板、封閉液、樣品稀釋液、抗原標準品、HRP標記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗、濃縮洗滌液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和終止液，其中，所述抗原標準品為純化的重組豬圓環病毒2型核衣殼蛋白（PCV2-Cap蛋白）。本發明專利技術試劑盒的特異性達100%，靈敏度高達4ng/ml，可用于豬群PCV2抗原檢測和PCV2疫苗產品的定量檢測。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒及其制備方法和其應用。
技術介紹
豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是引發斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原。除了引發 PMWS外，PCV2還與仔豬先天性震顫、豬皮炎腎炎綜合征、豬呼吸道綜合征(PDNS)、母豬繁殖障礙等疾病相關。自1996年在加拿大首次發現PMWS以來，PCV2感染引起的相關疾病已經在全世界廣泛存在。截止目前，我國養豬業受到PCV2感染的危害日益突出。因此，研制PCV2 抗原檢測試劑盒的臨床需求日益迫切。目前，國內外采用的PCV2檢測方法主要包括病毒分離培養、間接免疫熒光、免疫酶單層實驗(MPA)、原位雜交(ISH)、聚合酶鏈式反應(PCR)等。盡管這些方法可以檢測 PCV2，但存在使用不便，操作繁瑣，耗時長，不易普及等缺陷。CN102183650A公開了一種豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒，該試劑盒采用雙單抗結合技術檢測PCV2抗體。CN1584597A公開了一種豬圓環病毒2型抗原或抗體ELISA檢測試劑盒，其中，所述的抗原檢測試劑盒使用雙單抗夾心法，包被的抗體為原核表達的蛋白制備所得，并僅能依靠檢測孔的深淺來判斷強陽性、陽性、弱陽性和陰性等定性檢測結果。該文獻公開的試劑盒至今還沒有市場化，分析原因可能是試劑盒的特異性或敏感性不能滿足市場檢測的需要。 為此，急需研究一種能夠高效、定量檢測PCV2的方法。CN201110440750. 7公開了一種豬圓環病毒2型亞單位疫苗及其制備方法和其應用，該申請公開的內容全文作為本申請的參考。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有包被抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體的酶標板、封閉液、樣品稀釋液、抗原標準品、HRP標記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗、濃縮洗滌液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和終止液，其中，所述抗原標準品為純化的重組桿狀病毒表達的形成病毒樣顆粒 (VLPs)的豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)，所述酶底物A溶液為3，3’-5，5’-四甲基聯苯胺溶液，所述的酶底物B溶液為含有雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液。本專利技術的優選技術方案中，所述的包被抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體的酶標板孔包被的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體為由純化的重組桿狀病毒表達的形成病毒樣顆粒(VLPs)的豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)作為抗原免疫實驗兔后純化血清所得，所 述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的包被量為O.1 μ g-5 μ g/孔，包被稀釋液為O. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液，其中，所述碳酸鹽緩沖液的pH9. 6。本專利技術的優選技術方案中，所述碳酸鹽緩沖液的組成為，每升碳酸鹽緩沖溶液中含有1. 59g Na2CO3 和 2. 93g NaHCO3。本專利技術的優選技術方案中，所述封閉液選自質量濃度為1-10%的BSA、質量濃度為 1-10%的脫脂牛奶的任一種或其組合。本專利技術的優選技術方案中，所述樣品稀釋液由質量濃度為O. 1-10%牛血清白蛋白 (BSA)和含有O. 01-0. 05%NaN3的磷酸鹽緩沖液(PBS)組成，其中，所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為 O. 01mol/L, ρΗ7· 2-7. 4。本專利技術的優選技術方案中，所述濃縮洗滌液為含有O. 5v/v%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，其中，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為O. lmol/L, pH7. 2-7. 4。本專利技術的優選技術方案中，所述的酶底物A溶液為10mg/ml的3，3’ _5，5’ -四甲基聯苯胺(TMB)溶液；所述的酶底物B溶液為含有O. 012% (質量濃度)雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為10mg/ml，pH5. O。本專利技術的優選技術方案中，所述終止液為lmol/L H2SO4溶液。本專利技術的優選技術方案中，所述樣品稀釋液的配制為配制PH7.2-7.4、濃度為O. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液，再加入BSA和NaN3,使其濃度分別為O. 1_10%BSA和 0. 01-0. 05%NaN3,即得。本專利技術的優選技術方案中，所述濃縮洗滌液的配制為在0. lmol/L PBS溶液中加入吐溫-20 (Tween-20)，使得吐溫-20的濃度為0. 5v/v%。本專利技術的優選技術方案中，所述的酶底物A溶液為10mg/ml的3，3’ _5，5’ -四甲基聯苯胺(TMB)溶液，其配制為稱取IOOmg TMB，將其加入到IOml 二甲基亞砜(DMSO)中，完全溶解后，即得。本專利技術的優選技術方案中，所述的酶底物B溶液為0. 012%雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為10mg/ml，pH5. 0，其配制為稱取IOg乙酸鈉，溶于IL純化水，用乙酸調PH5. O,再加入400 μ I濃度為30%Η202，即得。 本專利技術的優選技術方案中，所述顯色液用酶底物B溶液100倍稀釋酶底物A溶液制得。本專利技術的優選技術方案中，所述的試劑盒中還含有抗原標準品和陰性對照液，其中抗原標準品的配制為用樣品稀釋液稀釋重組PCV2-Cap蛋白，將其配制至lug/ml而得；所述的陰性對照液用樣品稀釋液100倍稀釋不含PCV2抗原的豬陰性血清配制而成。本專利技術的優選技術方案中，所述重組PCV2_Cap蛋白的制備方法包括如下步驟(I)獲得本專利技術所述的重組桿狀病毒轉移載體pFastBac Dual_20RF2 ；(2)同源重組，產生重組桿狀病毒DNA ；(3)包裝，產生表達PCV2衣殼蛋白的重組桿狀病毒；(4)獲得本專利技術制備的重組桿狀病毒；(5)培養宿主細胞，接種步驟(4)的重組桿狀病毒；(6)滅活病毒；(7)分離純化重組PCV2Cap蛋白。在本專利技術的一個優選技術方案中，所述重組桿狀病毒轉移載體是分別在PFastBacDual轉移載體的PlO啟動子和Ppolh啟動子(多角體蛋白啟動子)之后各插入一個拷貝的PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2。在本專利技術的一個優選技術方案中，所述的PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2是完整的、 未經修飾的PCV2b 0RF2。在本專利技術的一個優選技術方案中，所述的PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。在本專利技術的一個優選技術方案中，所述PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2分別通過 BamHI/Hind III 和 Kpn I/Xho I 雙酶切插入 pFastBac Dual 轉移載體中。在本專利技術的一個優選技術方案中，所述重組桿狀病毒轉移載體為 pFastBacDual_20RF2。在本專利技術的一個優選技術方案中，所述的同源重組是將步驟(I)所述的重組桿狀病毒轉移載體轉化進含穿梭載體Bacmid的大腸桿菌感受態細胞DHlOBac中，產生重組桿狀病毒DNA。在本專利技術的一個優選技術方案中，所述的包裝是將步驟(2)產生的重組桿狀病毒 DNA感染sf9細胞，包裝出重組桿狀病毒。在本專利技術的一個優選技術方案中，所述重組桿狀病毒為rBac_2本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有：包被抗PCV2?Cap蛋白的多克隆抗體的酶標板、封閉液、樣品稀釋液、抗原標準品、HRP標記的抗PCV2?Cap蛋白的單克隆抗體的二抗、濃縮洗滌液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和終止液，其中，所述抗原標準品為純化的重組桿狀病毒表達的形成病毒樣顆粒（VLPs）的豬圓環病毒2型核衣殼蛋白（PCV2?Cap蛋白），所述酶底物A溶液為3,3’?5,5’?四甲基聯苯胺溶液；所述的酶底物B溶液為含有雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液。

【技術特征摘要】
2011.12.26 CN 201110440750.7;2012.04.10 CN 2012101.一種豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的酶標板、封閉液、樣品稀釋液、抗原標準品、HRP標記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗、濃縮洗滌液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和終止液，其中，所述抗原標準品為純化的重組桿狀病毒表達的形成病毒樣顆粒(VLPs)的豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)，所述酶底物A溶液為3，3’ -5，5’ -四甲基聯苯胺溶液；所述的酶底物B溶液為含有雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液。2.根據權利要求1所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體為由純化的重組桿狀病毒表達的形成病毒樣顆粒(VLPs)的豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)作為抗原免疫實驗兔后純化血清所得，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的包被量為O.1 μ g-5 μ g/孔，包被稀釋液為O. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液，其中，所述碳酸鹽緩沖液的PH為9. 6。3.根據權利要求2所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述碳酸鹽緩沖液的組成為，每升碳酸鹽緩沖溶液中含有1. 59g Na2CO3和2. 93g NaHC03。4.根據權利要求1-3任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述封閉液選自質量濃度為1-10%的牛血清白蛋白(BSA)或質量濃度為1-10%的脫脂牛奶的任一或其組合。5.根據權利要求1-4任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述樣品稀釋液由質量濃度為O. 1-10%牛血清白蛋白和含有O. 01-0. 05%疊氮化鈉(NaN3)的磷酸鹽緩沖液組成，其中，所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為O. 01mol/L, pH7. 2-7. 4。6.根據權利要求1-5任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述濃縮洗滌液為含有O. 5% (v/v)吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，其中，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為O.lmol/L, ρΗ7· 2-7. 4。7.根據權利要求1-6任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述的酶底物A溶液選自濃度為10mg/ml的3，3’ -5，5’ -四甲基聯苯胺溶液；所述的酶底物B溶液含有質量濃度為O. 012%雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為IOmg/ml, pH 為 5. O。8.根據權利要求1-7任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述終止液為lmol/L的H2SO4溶液。9.根據權利要求1-8任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，其中，抗原標準品的配制為用樣品稀釋液稀釋重組PCV2-Cap蛋白至lug/ml制成。10.根據權利要求1-9任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述的試劑盒中還含有陰性對照液，所述的陰性對照液為用樣品稀釋液100倍稀釋不含PCV2抗原的豬陰性血清配制而成。11.根據權利要求1-1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：廖園園，漆世華，朱薇，李建，秦偉，王威，熊媛媛，張萍，秦紅剛，李偉，謝紅玲，溫文生，王楨楨，靖志強，吳玉石，韓興，劉潔，
申請(專利權)人：武漢中博生物股份有限公司，
類型：發明
國別省市：