本發明專利技術公開了一種檢測急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型的試劑盒，與七色流式細胞儀組成白血病相關免疫表型分類裝備，該試劑盒中配置了下述單克隆抗體試劑組合：CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19和CD45，依前后順序分別標準熒光素為：FITC、PE、PerCP-CY5,5、PE-CY7、APC、APC-Cy7和PacificBlue。采用本發明專利技術的試劑盒可以同時觀察7個標志是否存在異常，增加了檢測的靈敏度和準確性；而且可以不依賴于發病時的免疫表型資料，擴大了LAIP分析的范圍和能力，簡化了分析的前期條件，為臨床檢測MRD提供了更多的機會。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于細胞表型確認過程中的專用試劑盒，具體涉及一種檢測急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型的試劑盒及其應用。
技術介紹
隨著治療策略的改進和新的化療藥物不斷出現，急性淋巴細胞白血病(Acut elymphoblastic leukemia, ALL)的緩解率和生存率有了很大的提高,但是仍有一部分患者預后較差，最終死于復發。復發后即使采用強化療、甚至造血干細胞移植，仍然難以挽回患者的生命，給社會和家庭都造成了極其沉重的精神和經濟負擔。研究證明，治療后微量殘留病(MRD)的水平是復發的根源。 多參數流式細胞術(flow cytometry, FCM)是MRD檢測的常用方法之一,該方法是根據患者發病時的免疫標志，確定該患者白血病細胞的特異性標志，亦稱為白血病相關免疫表型(LAIP)，通過對LAIP的識別來檢測MRD。目前，國內外的文獻主要采用三色或四色的抗體組合來檢測LAIP，不同的研究機構采用不同的抗體組合，抗體選擇多樣化、分析時設門的方法也不一致。例如，歐洲主要報道了 5組三色的抗體組合，共應用15個抗體；美國St. jude兒童研究醫院則利用多組四色抗體組合。為了提高檢測的靈敏度，三色FCM或四色FCM常常需要多組抗體組合，每組抗體組合中均有相同的抗體，這樣一方面增加了抗體總數目，進而增加了試驗成本和患者的經濟負擔；另一方面多組抗體組合需要在多管中分別檢測，影響了對檢測抗體的多參數分析在分析LAIP時，有時需要多個標志設門來限定一群細胞，例如第一管抗體組合中發現一群可疑LAIP陽性細胞，表型為⑶45+⑶19+⑶10+CD3C，但此群細胞數較低(<; 1(Γ4)，此時往往需要觀察此群細胞中其他抗原是否表達異常，以確定是否存在LAIP ;但四色組合無法同時檢測第4種以外的抗體，從而影響了檢測的準確性；若要觀察此群細胞的第五種或其他的抗原表達是否有異常，利用四色FCM則無法完成。為了提高LAIP檢測的靈敏度，需要能夠同時檢測多個熒光參數的FCM、以及設計合適的更多熒光參數的抗體組合。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種檢測急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型的試劑盒及其應用，所述試劑盒采用七種熒光標記的抗體組合，利用該劑盒、并借助七色流式細胞儀的輔助，可快速準確地分析LAIP的種類、性質及判斷LAIP陽性細胞水平，對預后判斷和臨床治療方案的制定具有重要的指導意義。為解決上述技術問題，本專利技術采取的技術方案是一種檢測急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型的試劑盒，與七色流式細胞儀組成白血病相關免疫表型分類裝備，該試劑盒中配置了下述單克隆抗體試劑組合⑶58、⑶10、⑶34、CD123、CD38、CD19 和 CD45。優選的，所述單克隆抗體試劑組合⑶58、⑶10、⑶34、⑶123、⑶38、⑶19和⑶45依前后排列順序依次進行特異性熒光素標記為FITC、PE、Percp-CY5.5、PE-CY7、APC、APC-Cy7和 Pacific Blue。本專利技術還提供了上述試劑盒在制備檢測急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型的產品中的應用。借助于上述的試劑盒和七色流式細胞儀對急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型進行分析的方法，包括下述步驟 步驟一、試劑配制1.1、配制pH為7. 2 7. 4的10XPBS緩沖液，并稀釋10倍成為IXPBS緩沖液，1. 2、取溶紅細胞液，并用IXPBS緩沖液稀釋10倍， 1.3、取小牛血清加入至I XPBS緩沖液中，制備含O. 5wt. 9T2wt. %血清的PBS ； 步驟二、對骨髓標本進行熒光標記，制備測試標本 2.1在同一專用試管中，依次分別加入熒光標記的單克隆抗體如下3μΙΧ058-ΡΙΤ(、10 μ LCD10-PEU μ L CD34-PerCP-CY5. 5、I μ LCD123_PE_CY7、2 μ L CD38_APC、5 μ LCD19-APC-Cy7和1. 3μ L CD45_Pacific Blue，然后再加入100 μ L骨髓標本，混勻，室溫避光放置15分鐘孵育， 2.2、加入步驟1. 2中稀釋后的溶紅細胞液2mL，混勻后避光，室溫放置8分鐘，溶解紅細胞， 2.3、1500轉/分離心5分鐘，棄上清液，加入步驟1. 3中2mL含O. 5wt. %2wt. %血清的PBS，混勻， 2.4、1500轉/分離心5分鐘，棄上清液，加入步驟1.1中O. 3mLl X PBS緩沖液，混勻，制成待測標本； 步驟三、按照七色流式細胞儀的操作要求對待測標本進行處理后檢測，獲得特異性熒光標記的骨髓細胞數據，用MACSQuant分析軟件、在SSC/⑶19和⑶45/⑶19雙參數點圖中對⑶19+細胞進行連續兩次設門，并進一步在⑶19+細胞中對⑶19+⑶38 +的漿細胞設門以去除漿細胞，最終的CD19+B細胞為待測的細胞，并與正常骨髓細胞CD19+B祖細胞表型進行比較。采用上述試劑盒、并借助七色流式細胞儀分析B細胞來源急性白血病治療前和治療后肝素抗凝骨髓細胞中，是否具有LAIP細胞、LAIP細胞的表型及LAIP細胞的數量。該分析基于下列患者(1)初診B-ALL的患者294例；(2)慢性髓細胞白血病(Chronicmyelocytic leukemia, CML) -B細胞急性變患者20例；(3)復發的B-ALL患者70例(20例無發病免疫表型結果)；(4)治療后MRD+患者146例。其中LAIP的表現包括⑶45和⑶38的弱表達或不表達KDlO的強表達；及在⑶34+TdT+⑶10+分化階段時不表達⑶10 ；⑶19、CD34、CD123、CD58強表達。結果表明294例初診B-ALL患者、20例CML-B細胞急性變、70例復發B-ALL患者中，LAIP陽性率占99. 22%、其中92. 2%患者的LAIP表現為兩種抗原的表達異常。上述結果表明采用本專利技術的試劑盒對LAIP的檢測具有較高的敏感性和特異性。在146例MRD+患者的328份標本中均存在LAIP+，LAIP的表型特征與治療前的相似。充分證明本專利技術的試劑盒適用于99%以上初診的及治療后的B細胞來源的急性白血病患者LAIP表型的判斷和分析，為臨床檢測MRD提供依據。采用上述技術方案產生的有益效果在于(1)本專利技術的試劑盒首次采用7種標記有不同熒光素的抗體組合，能夠同時分析7個抗原的特點，經過大量的臨床驗證證明，在B細胞來源的急性淋巴細胞白血病中LIAP的陽性率達到99%以上，可快速、準確地檢測初診為B-ALL患者、CML-B細胞急性變、復發B-ALL患者和MRD+患者骨髓中LAIP細胞，為B淋巴細胞白血病LAIP分析提供了一種可靠的、新的熒光標記的單克隆抗體組合；(2)本專利技術采用較少的抗體、能夠檢出較多的LAIP細胞，降低了試驗成本和患者的經濟負擔，而且單管中抗體的種類增多、增加了檢測的靈敏度和準確性；(3)采用本專利技術的試劑盒可以不依賴于發病時的免疫表型資料，擴大了 LAIP分析的范圍和能力，簡化了分析的前期條件，為臨床檢測MRD提供了更多的機會；(4)利用本試劑盒中的一組抗體組合，利于LAIP分析的標準化和規范化。 附圖說明圖1是正常骨髓B組細胞表型示例 圖2 圖4分別列舉了 B-ALL治療后標本中LAIP+細胞本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型的試劑盒，與七色流式細胞儀組成白血病相關免疫表型分類裝備，其特征在于該試劑盒中配置了下述單克隆抗體試劑：CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19和CD45。
【技術特征摘要】
1.一種檢測急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型的試劑盒，與七色流式細胞儀組成白血病相關免疫表型分類裝備，其特征在于該試劑盒中配置了下述單克隆抗體試劑CD58、 CD10、CD34、CD123、CD38、CD19 和 CD45。2.根據權利要求1所述的檢測急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型的試劑盒，其特征在于所述單克隆抗體試劑⑶58、⑶10、⑶34、⑶123、⑶38、⑶19和⑶45依前后排列順序依次進行特異性熒光素標記為FITC、PE、Percp-CY5. 5、PE_CY7、APC、APC_Cy7 和 Pacific Blue。3.根據權利要求1所述的檢測急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還設置了溶紅細胞液和PH為7. 2 . 4的10XPBS緩沖液。4.根據權利要求3所述的檢測急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還設置了配套計量的小牛血清試劑。5.根據權利要求廣4任意一項所述試劑盒在制備檢測急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型的產品中的應用。6.借助于權利要求4所述的試劑盒和七色流式細胞儀對急性B淋巴細胞白血病相關免疫表型進行分析的方法，其特征在于該方法包括下述步驟步驟一、試劑配制1.1、配制pH為7. 2 7. 4的10XPBS緩沖液，并稀釋10倍成為I XPBS緩沖液，1. 2、取溶紅細胞液，并用IXPBS緩沖液稀釋10倍，.1.3、取...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉艷榮，王亞哲，常艷，郝樂，黃曉軍，
申請(專利權)人：北京大學人民醫院，
類型：發明
國別省市：
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